多種腫瘤標(biāo)志物在肺腺癌中的表達(dá)及預(yù)后意義的研究

楊欣 薛麗燕 郭蕾 溫芃 林冬梅

腺癌作為最常見(jiàn)的肺癌組織學(xué)類型，在全球及我國(guó)發(fā)病率均呈上升趨勢(shì)[1]。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的發(fā)病有明顯的性別差異，尤其是腺癌。腺癌占女性原發(fā)肺癌的75%，是年輕非吸煙患者的主要組織學(xué)類型[2,3]，近年與腺癌表達(dá)及預(yù)后相關(guān)標(biāo)記物的研究已成為熱點(diǎn)。本研究中采用免疫組化方法，檢測(cè)一組標(biāo)記物在肺腺癌組織中表達(dá)情況，分析其表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2003年1月-2006年12月中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除（腫瘤及其所在肺葉+區(qū)域淋巴結(jié)清掃）且隨訪資料完整，明確診斷肺腺癌的患者227例?；颊咝g(shù)前均未行放、化療。肺癌腫瘤組織經(jīng)常規(guī)甲醛固定、石蠟包埋。按照第7版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer, AJCC）腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期。記錄患者性別、年齡、吸煙史、分期、分化程度、術(shù)后治療（包括化療、放療及靶向治療）及隨訪情況等。將吸煙史按照吸煙（包括當(dāng)前吸煙——正吸煙或戒煙＜12個(gè)月和既往吸煙——一生累積吸煙量＞100支，肺癌確診前戒煙＞12個(gè)月）和非吸煙（從未吸煙或一生累積吸煙量＜100支）進(jìn)行分組分析。

1.2 材料 組織芯片儀采用Tissue Microarrayer，美國(guó)Beecher Instruments公司產(chǎn)品。一抗來(lái)源：小鼠單克隆抗體Napsin，Abcam公司產(chǎn)品，原液1:100稀釋；小鼠單克隆抗體TTF-1、兔單克隆抗體ERα、兔多克隆抗體ERβ、小鼠單克隆抗體PR、小鼠單克隆抗體Bcl-2及兔多克隆抗體RRM1，北京中杉生物技術(shù)公司，工作液；小鼠單克隆抗體HER2及小鼠單克隆抗EGFR野生型抗體，Dako公司，工作液；小鼠單克隆抗體ERCC1，福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品，工作液。二抗來(lái)源：Ventana即用型抗體。

1.3 方法

1.3.1 組織芯片（tissue microarray, TMA）的構(gòu)建 選取并標(biāo)記HE切片上具有代表性的腫瘤區(qū)域及相應(yīng)蠟塊。將所需的靶組織（每例選取2個(gè)腫瘤組織芯）用直徑1.0 mm的吸針從供體蠟塊靶區(qū)取出，按芯片設(shè)計(jì)的排列順序定位裝載在受體蠟塊中。受體蠟塊連續(xù)4 μm切片備用。

1.3.2 免疫組化染色 白片經(jīng)70oC烤箱烤至少1 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化至蒸餾水后行抗原修復(fù)，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0，Napsin A、ERα、ERβ、PR、HER2、EGFR、ERCC1）或1 mM EDTA（pH=9.0，TTF-1、RRM1）高壓抗原修復(fù)2.0 min。一抗室溫孵育1 h，通用型二抗室溫孵育15 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染。

1.3.3 免疫組化染色結(jié)果判定 （1）陽(yáng)性染色定位：TTF-1、ERα、ERβ、PR 、ERCC1陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核，HER2為細(xì)胞膜，EGFR為細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞漿，Bcl-2、RRM1為細(xì)胞漿。（2）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①Napsin A、TTF-1、EGFR、Bcl-2、ERCC1、RRM1：（-）無(wú)腫瘤細(xì)胞著色，（1+）為淺黃色，（2+）為棕黃色，（3+）為黑棕色。③ERα、ERβ、PR：（-）無(wú)腫瘤細(xì)胞著色或著色腫瘤細(xì)胞數(shù)＜5%，（1+）著色細(xì)胞數(shù)為5%-25%，（2+）著色細(xì)胞數(shù)26%-50%，（3+）著色細(xì)胞數(shù)＞50%。④HER2：（-）無(wú)著色，（1+）任何比例的癌細(xì)胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細(xì)胞膜著色，（2+）＞10%的癌細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中等強(qiáng)度、完整但不均勻的細(xì)胞膜棕黃著色或＜30%的浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)且完整的細(xì)胞膜棕褐著色，（3+）＞30%的癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)的、完整的細(xì)胞膜棕褐著色。同一例兩個(gè)組織芯片染色不一致時(shí)以高評(píng)分為準(zhǔn)。由2名病理醫(yī)師分別閱片，結(jié)果一致者為最后判定結(jié)果。HER2蛋白染色結(jié)果以2+及以上定義為陽(yáng)性組（+）進(jìn)行結(jié)果分析，其他9種蛋白以1+及以上定義為陽(yáng)性組（+）進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)比較不同臨床病理特征病例的癌組織中各蛋白表達(dá)差異，采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行單因素生存分析，Cox回歸進(jìn)行多因素生存分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于組織芯片技術(shù)的免疫組化檢測(cè)有效率 組織芯片制作過(guò)程中常出現(xiàn)脫靶（所取靶區(qū)腫瘤組織連續(xù)切片后消失）及免疫組化染色操作過(guò)程中組織樣品脫片現(xiàn)象，本研究中10種標(biāo)記物檢測(cè)有效率為91.2%-95.6%（表1）。

2.2 臨床病理特征和預(yù)后 男性137例，女性90例，男女比例為1.52:1。中位年齡61歲。223例患者有吸煙史資料，吸煙者96例，非吸煙者127例。病理分期為I期145例，II期33例，III期45例，IV期4例。分化程度為高分化39例，中分化109例，低分化79例。術(shù)后行輔助治療34例（I期8例：?jiǎn)位?例，放、化療1例，靶向治療1例，治療方式不詳1例；II期、III期、IV期共26例：?jiǎn)畏暖?例，單化療13例，放、化療10例），5年總生存率和5年無(wú)病生存率分別為72.8%和65.3%；未行輔助治療193例，5年總生存率和5年無(wú)病生存率分別為70.2%和61.8%，術(shù)后治療和非治療組之間總生存和無(wú)病生存均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。隨訪時(shí)間為3個(gè)月-99個(gè)月，所有患者的5年總生存率為72.2%，其中I期、II期、III期和IV期患者的5年總生存率分別為88.1%、63.1%、33.3%和0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.001）。

表 1 10種蛋白在組織芯片中的檢測(cè)有效率Tab 1 Testing efficiency of 10 markers on TMA sections

2.3 蛋白在肺腺癌中的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 免疫組化方法檢測(cè)10種蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)情況見(jiàn)圖1。其中僅Napsin A蛋白表達(dá)與性別有關(guān)（P=0.049）。Napsin A、PR及EGFR蛋白表達(dá)與吸煙有關(guān)，TTF-1和ERCC1蛋白表達(dá)與腫瘤大小有關(guān)，Napsin A、TTF-1、ERα和PR蛋白表達(dá)與分化程度有關(guān)，表達(dá)與病理分期有關(guān)的是TTF-1、Bcl-2和ERCC1蛋白（P＜0.05）。未觀察到上述蛋白表達(dá)與患者年齡有關(guān)，ERβ、HER2和RRM1蛋白表達(dá)與性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、分化程度及病理分期均無(wú)關(guān)性（P＞0.05）（表2）。

2.4 生存分析 單因素生存分析評(píng)估臨床病理特征與預(yù)后關(guān)系，其中腫瘤大小、分化程度和病理分期與總生存（overall survival, OS）和無(wú)病生存（disease-free survival,DFS）有關(guān)（P＜0.05）（表3）；單因素生存分析 10種蛋白在腫瘤組織中表達(dá)與預(yù)后：Napsin A、TTF-1和ERCC1蛋白表達(dá)與OS有關(guān)（圖2A-圖2C）；TTF-1蛋白表達(dá)與患者DFS有關(guān)（圖2D）（P＜0.05）（表4）。進(jìn)一步對(duì)I期患者進(jìn)行分析，僅Napsin A蛋白表達(dá)與I期患者OS有關(guān)（圖2E）（P＜0.05）。未觀察到表達(dá)與I期患者無(wú)病生存有關(guān)的蛋白（P＞0.05）（表5）。多因素生存分析，僅病理分期是患者總生存和無(wú)病生存相關(guān)的預(yù)后因素（P＜0.05），未發(fā)現(xiàn)表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)的蛋白（P＞0.05）（表6）。

3 討論

目前TNM分期是評(píng)估肺癌預(yù)后最重要的指標(biāo)，但相同分期患者預(yù)后存在顯著差別，即使根治性切除的I期肺腺癌病例，5年復(fù)發(fā)率也有40%[4]。因此，尋找可以提示預(yù)后的分子病理標(biāo)志物是肺癌研究亟待解決的問(wèn)題。

TTF-1和Napsin A作為肺腺癌敏感性及特異性均較好的標(biāo)記物，臨床最常組合應(yīng)用于肺腺癌組織學(xué)亞型的鑒別診斷中，近年TTF-1還被視作一個(gè)潛在的NSCLC預(yù)后標(biāo)記物，高表達(dá)者預(yù)后好[5,6]。本研究結(jié)果顯示TTF-1表達(dá)與5年總生存及無(wú)病生存均相關(guān)，高表達(dá)者預(yù)后好，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)TTF-1蛋白表達(dá)與腫瘤大小、分化程度和病理分期相關(guān)，在最大徑≤2 cm、高分化和I期患者腫瘤組織中表達(dá)率高，而以上3項(xiàng)臨床病理特征均是公認(rèn)提示預(yù)后好的因素，也間接為T(mén)TF-1高表達(dá)提示患者預(yù)后好提供佐證。Napsin A是肺和腎組織中均有表達(dá)的天冬氨酸蛋白酶，能夠分離表達(dá)于II型肺泡上皮的表面活性蛋白B（SP-B）前體。隨著肺腺癌分子檢測(cè)和靶向治療的進(jìn)展，使NSCLC亞型分類的意義愈發(fā)明顯，目前Napsin A在NSCLC鑒別腺癌亞型中的應(yīng)用較廣泛，然而至今關(guān)于Napsin A表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的意義研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)Napsin A蛋白表達(dá)與性別、吸煙史及腫瘤分化程度有關(guān)，女性、非吸煙者及高分化者陽(yáng)性率高，且不論在所有病期還是I期病例中陽(yáng)性患者總生存率高于陰性者，結(jié)果與Lee等[7]研究一致。

ERα、ERβ及PR是類固醇受體，屬于核受體超家族。雌、孕激素受體不僅存在于乳腺、子宮等雌激素靶器官，近年來(lái)的研究[8]表明，在NSCLC和正常肺組織中亦有表達(dá)，且表達(dá)與特定的臨床病理特征與預(yù)后有關(guān)。本研究顯示ERα及PR蛋白表達(dá)均與腫瘤分化程度有關(guān)，分化好者高表達(dá)，PR蛋白表達(dá)還與吸煙有關(guān)，非吸煙者陽(yáng)性率高，但二者表達(dá)均未顯示與預(yù)后有關(guān)。ERβ蛋白表達(dá)既與臨床病理特征無(wú)關(guān)也未發(fā)現(xiàn)有預(yù)后提示意義。包括本研究在內(nèi)，NSCLC或肺腺癌中ERα、ERβ和PR蛋白表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系的相關(guān)研究結(jié)果尚存爭(zhēng)議[9-12]，可能與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的選擇偏倚、實(shí)驗(yàn)條件差異及抗體克隆選擇不同有關(guān)，也可能與不同研究組免疫組化結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)差異有關(guān)。尚需更多研究探索它們?cè)诜蜗侔┌l(fā)生和發(fā)展中的意義。

圖1 免疫組化方法檢測(cè)10種蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)。A：Napsin A（×200）；B：TTF1（×200）；C：ERα（×200）；D：ERβ（×400）；E：PR（×200）；F：Bcl-2（×200）；G：HER2（×400）；H：EGFR（×200）；I：ERCC1（×400）；J：RRM1（×400）。Fig 1 Expression of 10 markers in lung adenocarcinoma analyzed by immunohistochemistry. A: Napsin A (×200); B:TTF1 (×200); C: ERα (×200); D: ERβ (×400); E:PR (×200); F: Bcl-2 (×200); G: HER2 (×400); H:EGFR (×200); I: ERCC1 (×400); J: RRM1 (×400).

表 2 10種蛋白表達(dá)及與患者臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 The relationship between expression of 10 tumor biomarkers and clinicopathological characteristics in the patients with lung cancer

表 2 10種蛋白表達(dá)及與患者臨床病理特征的關(guān)系（續(xù)表）Tab 2 The relationship between expression of 10 tumor biomarkers and clinicopathological characteristics in the patients with lung cancer(continued)

表 2 10種蛋白表達(dá)及與患者臨床病理特征的關(guān)系（續(xù)表）Tab 2 The relationship between expression of 10 tumor biomarkers and clinicopathological characteristics in the patients with lung cancer(continued)

表 2 10種蛋白表達(dá)及與患者臨床病理特征的關(guān)系（續(xù)表）Tab 2 The relationship between expression of 10 tumor biomarkers and clinicopathological characteristics in the patients with lung cancer(continued)

表 3 單因素分析臨床病理特征與5年總生存率和5年無(wú)病生存率關(guān)系Tab 3 The relationship among the clinicopathologic characteristics, 5-year overall survival (OS) and 5-year disease-free survival (DFS) analyzed by univariate analysis

Bcl-2是一種癌基因，其蛋白產(chǎn)物是細(xì)胞凋亡蛋白家族成員之一，分子量25 kDa的線粒體內(nèi)膜蛋白，表達(dá)于一系列淋巴組織增生性疾病和包括肺癌在內(nèi)的多種非造血系統(tǒng)惡性腫瘤中。Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡，因此認(rèn)為該蛋白過(guò)表達(dá)的腫瘤可能會(huì)獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。Bcl-2蛋白表達(dá)與肺癌臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系研究不多，本研究中Bcl-2蛋白表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)，病期晚者陽(yáng)性率高，但生存分析未顯示其表達(dá)對(duì)患者預(yù)后有提示意義，結(jié)果與Yaren等[13]和Hanaoka等[14]報(bào)道一致。

EGFR和HER-2/neu均為表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員，在細(xì)胞信號(hào)傳到中發(fā)揮重要的作用，是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡的重要調(diào)節(jié)者。該家族包括EGFR（HER1或erbB1）、HER2（neu或erbB2）、HER3（erbB3）及HER4（tyro2或erbB4）。近年肺腺癌治療和預(yù)后相關(guān)研究最重要的分子事件是EGFR突變，主要集中在外顯子19（A746-A750）缺失突變和外顯子21（L858R）點(diǎn)突變，是晚期肺腺癌一線EGFR-酪氨酸激酶抑制劑治療療效的預(yù)測(cè)因子[15]。還有研究[16]報(bào)道即使接受傳統(tǒng)的化療，EGFR突變陽(yáng)性的患者也顯示較好的臨床轉(zhuǎn)歸，因此提示EGFR突變?yōu)樘崾绢A(yù)后好的分子指標(biāo)。而野生型EGFR蛋白反映EGFR基因擴(kuò)增狀態(tài)，與EGFR突變情況無(wú)平行關(guān)系，因此EGFR基因突變的預(yù)后價(jià)值不能代表野生型EGFR蛋白表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系。本研究EGFR抗體為抗野生型EGFR基因蛋白，結(jié)果顯示其表達(dá)與吸煙有關(guān)，非吸煙患者陽(yáng)性率高，但未觀察到野生型EGFR蛋白表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)，提示相對(duì)EGFR基因拷貝數(shù)的增加，EGFR基因突變對(duì)于評(píng)估肺腺癌預(yù)后可能更有意義。雖然近年來(lái)HER-2/neu在乳腺癌中得到廣泛研究，且分別針對(duì)基因擴(kuò)增狀態(tài)及蛋白表達(dá)情況的熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）和免疫組化檢測(cè)技術(shù)臨床應(yīng)用均已成熟，但目前在肺癌中HER2蛋白表達(dá)情況及預(yù)后價(jià)值信息較少。一項(xiàng)HER2與肺癌預(yù)后關(guān)系的薈萃分析[17]中，納入薈萃分析的多數(shù)免疫組化方法研究以染色結(jié)果2+及以上為HER2蛋白陽(yáng)性判定值，結(jié)論顯示HER2蛋白過(guò)表達(dá)提示肺癌尤其小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和早期NSCLC預(yù)后不良。本研究以免疫組化染色結(jié)果2+及以上定義為HER2陽(yáng)性組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示肺腺癌中HER2蛋白表達(dá)與各臨床病理因素均無(wú)相關(guān)性，陽(yáng)性組與陰性組生存率亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果可能受到研究樣本量小、樣本來(lái)源單中心及對(duì)免疫組化方法檢測(cè)的HER2蛋白陽(yáng)性定義標(biāo)準(zhǔn)等限制，HER2蛋白在肺腺癌中表達(dá)陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)及其對(duì)肺腺癌患者的預(yù)后意義需進(jìn)一步研究和探討。

表 4 單因素分析各蛋白表達(dá)與5年總生存率和5年無(wú)病生存率關(guān)系Tab 4 The relationship among the expression of tumor markers, 5-year overall survival (OS) and 5-year disease-free survival (DFS) analyzed by univariate analysis

ERCC1蛋白是核苷酸切除修復(fù)通路中高度保守的單鏈DNA核酸內(nèi)切酶，參與識(shí)別和切除DNA加合物，在核苷酸切除修復(fù)中起到限速或調(diào)節(jié)的重要作用。RRM1是核糖核苷酸還原酶的調(diào)節(jié)單位，參與減少DNA合成和修復(fù)需要的核苷酸向脫氧核糖核蛋白的轉(zhuǎn)化。RRM1還增加10號(hào)染色體磷酸酶和張力蛋白缺失，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，遷移和轉(zhuǎn)移潛能降低，是新型化療吉西他濱的重要靶點(diǎn)。近年來(lái)有研究[18,19]報(bào)道肺癌組織中ERCC1和RRM1蛋白表達(dá)與治療反應(yīng)和患者預(yù)后的關(guān)系等。2009美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）推薦ERCC1和RRM1蛋白表達(dá)與EGFR基因突變一起，作為評(píng)估肺癌預(yù)后與預(yù)測(cè)治療的標(biāo)記物。但最近Friboulet等[20]研究卻發(fā)現(xiàn)，多種市售ERCC1抗體不能有效識(shí)別同時(shí)具備核苷酸切除修復(fù)功能和鉑類抵抗的全能型異構(gòu)體，因此通過(guò)免疫組化方法獲得的ERCC1蛋白表達(dá)情況，在不同研究或相同病例不同次檢測(cè)中的重復(fù)性差，導(dǎo)致其預(yù)后和預(yù)測(cè)作用有限。本研究觀察到ERCC1蛋白表達(dá)與腫瘤大小和病理分期有關(guān)，腫瘤小和早期患者陽(yáng)性率高，并且表達(dá)與預(yù)后有關(guān)，陽(yáng)性組5年總生存率明顯高于陰性組，提示ERCC1是提示肺腺癌預(yù)后好的標(biāo)記物，但未多次或選擇不同病例庫(kù)驗(yàn)證。本研究中RRM1蛋白表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后均無(wú)關(guān)，推測(cè)可

能亦存在抗體與蛋白異構(gòu)體識(shí)別特異性差的問(wèn)題，另外在免疫組化染色結(jié)果判讀中還發(fā)現(xiàn)，RRM1抗體的非特異性著色問(wèn)題較其他抗體明顯，尚需優(yōu)化技術(shù)平臺(tái)進(jìn)一步論證其與臨床預(yù)后的關(guān)系。

表 6 多因素分析病理特征和蛋白表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后關(guān)系Tab 6 The correlations among clinicopathologic features and tumor marker expression with 5-year overall survival (OS)/5-year disease-free survival (DFS) in the patients with adenocarcinoma analyzed by mutivariate analysis

圖 2 生存曲線。A：全部病例Napsin A蛋白總生存曲線；B：全部病例TTF1蛋白總生存曲線；C：全部病例ERCC1蛋白總生存曲線；D：全部病例TTF1蛋白無(wú)病生存曲線；E：I期病例Napsin A蛋白總生存曲線。Fig 2 Survival curves. A: OS curves for Napsin A in all cases; B: OS curves for TTF1 in all cases. C: OS curves for ERCC1 in all cases; D: DFS curves for TTF1 in all cases; E: OS curves for Napsin A in stage I cases.

綜上，免疫組化方法檢測(cè)相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)以評(píng)估肺腺癌預(yù)后有一定臨床應(yīng)用價(jià)值：TTF-1、Napsin A和ERCC1蛋白可能是提示肺腺癌患者預(yù)后較好的標(biāo)記物。