525例肺癌中ALK陽性病例臨床病理特征研究及檢測方法探討

朱翔 李紅威 曹寶山 柳晨 梁莉 王玉湘 由江峰 高菲 馬曉龍 劉巖 王華 張燕 陳劍 張波

肺癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。近年來，隨著其發(fā)病率的節(jié)節(jié)攀升，以分子靶向治療為核心內(nèi)容的個體化治療已經(jīng)成為肺癌治療的研究熱點，肺癌相關(guān)靶向分子的檢測也越來越受到關(guān)注。棘皮動物微管相關(guān)蛋白-間變性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubuleassociated protein-like 4 gene and the anaplastic lymphoma kinase gene, EML4-ALK）融合基因是2007年Soda等[2]在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者的腫瘤標(biāo)本中首次發(fā)現(xiàn)。EML4-ALK融合基因是由ALK基因在2號染色體短臂內(nèi)倒位inv（2）（p21p23）與其相鄰的EML4基因重接形成的。有研究[3]表明EML4-ALK可誘導(dǎo)肺癌發(fā)生，在給予ALK酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor,TKI）后腫瘤可迅速消退?？诉蛱婺幔╟rizotinib）作為一種ALK-TKI，對存在EML4-ALK融合基因的肺癌患者進(jìn)行靶向治療，已正式應(yīng)用于臨床。已有研究[4]證實是否存在EML4-ALK融合基因?qū)τ诳诉蛱婺岬寞熜芮邢嚓P(guān)。因此，對肺癌患者的EML4-ALK融合基因檢測具有十分重要的意義[5]。2013年，我國出臺了關(guān)于中國NSCLC ALK檢測的相關(guān)指南[6]，因此，我們按照指南對實際工作中的病例進(jìn)行ALK基因檢測和分析總結(jié)，為深入研究我國肺癌病例中ALK融合基因狀況及陽性病例的臨床病理特征，從而為臨床進(jìn)一步的生物靶向治療提供可靠的依據(jù)。

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因是與肺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的另一個重要的驅(qū)動基因。人們曾經(jīng)認(rèn)為EGFR的突變與ALK融合基因在同一個病例中是互相排斥的[7]，但隨著ALK檢測的大范圍開展，人們發(fā)現(xiàn)了ALK與EGFR雙突變的病例[8,9]，臨床上這些雙突變的患者對EGFR-TKI及ALK-TKI均可能有療效[8]。在我們的病例中這種情況的發(fā)生率有多少，免疫組化在確診雙突變中的意義，是我們關(guān)注的問題。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年9月-2013年12月北京大學(xué)第三醫(yī)院病理科的肺癌存檔標(biāo)本及部分來自外院的肺癌會診病例共525例。肺癌的分型診斷參照世界衛(wèi)生組織（World Health Organization）編寫的肺、胸膜、胸腺及心臟腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)（2004年版）診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中肺腺癌組織學(xué)亞型的診斷參照2011年國際肺癌研究協(xié)會/美國胸科學(xué)會/歐洲呼吸學(xué)會（International Association for the Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society, IASLC/ATS/ERS）聯(lián)合制定的肺腺癌新分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型[10,11]。標(biāo)本類型包括肺葉切除標(biāo)本、肺楔形切除標(biāo)本、CT引導(dǎo)經(jīng)皮肺穿刺標(biāo)本、支氣管鏡粘膜活檢標(biāo)本、鎖骨上/腋窩淋巴結(jié)活檢標(biāo)本、胸膜活檢標(biāo)本、椎體腫物穿刺以及胸水沉渣。每例標(biāo)本的病理組織學(xué)診斷均由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)生重新復(fù)核。

1.2 免疫組化方法檢測ALK蛋白的表達(dá)

1.2.1 實驗方法 525例肺癌組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度切片。免疫組化采用Envision法。兔單克隆抗體ALK（D5F3）抗體購自Cell Signaling Technology公司。免疫組化二抗SP檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ALK（D5F3）抗體按1:250稀釋），應(yīng)用PBS代替一抗作為陰性對照，按照試劑說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 結(jié)果判讀[6,12,13]0/陰性：腫瘤細(xì)胞明確無著色；1+：＞5%腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)微弱或模糊的胞漿著色；2+：＞5%腫瘤細(xì)胞中等強度胞漿著色；3+：＞5%腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)顆粒狀胞漿強著色。

1.3 ALK基因的FISH檢測

1.3.1 實驗方法 525例肺癌病例中有34例肺癌標(biāo)本進(jìn)行了ALK基因的FISH檢測，使用經(jīng)FDA認(rèn)證的ALK雙色分離探針試劑盒（Vysis LSI ALK Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe, Abbott Molecular）。根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行操作。石蠟切片通過脫蠟等預(yù)處理過程之后，依次進(jìn)行抗原修復(fù)、組織消化、變性、孵育雜交、洗滌及核復(fù)染。

1.3.2 結(jié)果判讀 在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取50個腫瘤細(xì)胞，要求腫瘤細(xì)胞核輪廓及信號清晰，每個細(xì)胞核內(nèi)至少有一組紅、綠信號，如果紅綠信號分離（距離≥兩個信號直徑）或額外出現(xiàn)單獨的紅色信號，視為陽性細(xì)胞，50個觀察細(xì)胞中陽性細(xì)胞＜5個為陰性標(biāo)本，＞25個為陽性標(biāo)本，如果在5個-25個之間則再計數(shù)50個細(xì)胞，100個細(xì)胞內(nèi)合計陽性細(xì)胞數(shù)≥15個為陽性標(biāo)本。

1.4 EGFR基因檢測 525例肺癌病例中有34例肺癌標(biāo)本應(yīng)用直接測序法或擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutationsystem, ARMS）（Qiagen Inc, Valencia, CA）[14]方法檢測EGFR基因突變情況。實驗按照試劑說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行分析處理。組間率的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者臨床資料特點（表1） 525例肺癌中≥50歲者共476例，＜50歲者共49例，發(fā)病中位年齡為63歲（30歲-88歲）。。應(yīng)用免疫組化方法檢測陽性組的患者更年輕，與陰性組相比具有差異（P=0.002）。525例肺癌患者中男284例，女241例，男:女=1.169:1。陽性組病例中女性患者更多見，與陰性組相比具有差異（P=0.002）。

2.2 標(biāo)本類型特點 本次研究標(biāo)本類型呈多樣化特點，最常見的標(biāo)本類型是CT引導(dǎo)經(jīng)皮肺穿刺（368例），此外包括較常見的手術(shù)切除肺標(biāo)本（69例）、支氣管鏡粘膜活檢標(biāo)本（49例）、胸水沉渣（17例）、胸膜活檢（8例），以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本：鎖骨上/腋窩淋巴結(jié)活檢標(biāo)本（10例）、椎體腫物穿刺（4例）。

2.3 標(biāo)本組織學(xué)類型特點（表1） 525例肺癌經(jīng)免疫組織化學(xué)方法檢測ALK（D5F3）在腫瘤細(xì)胞胞漿中的表達(dá)，陽性者27例，陽性率為5.14%。陽性病例中24例為肺腺癌（陽性率6%），2例為鱗狀細(xì)胞癌（陽性率2.13%），1例為腺鱗癌（陽性率7.69%）。其余類型的肺癌，如大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌、混合型癌、類癌等肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤均為陰性。肉瘤樣癌及腺樣囊性癌均為1例，均陰性。ALK陽性組與ALK陰性組在腺癌的組織學(xué)亞型上存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（表1）。ALK陽性組實體型腺癌更常見（P=0.002），而ALK陰性組腺泡型更常見（P=0.037）。29例貼壁型肺腺癌ALK免疫組化均為陰性（P＜0.001）。乳頭型與微乳頭型在ALK陽性組與陰性組之間無差異。文獻(xiàn)中提到的ALK融合基因更常見于印戒細(xì)胞＞10%或伴有粘液腺癌分化的組織學(xué)特點[15]在本研究中未能體現(xiàn)（P＞0.05）。鱗癌及腺鱗癌的比例在ALK陽性組與ALK陰性組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表 1 525例肺癌患者腫瘤細(xì)胞中ALK蛋白表達(dá)情況及與臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 Correlation between ALK protein expression and clinicopathological factors in 525 lung cancer patients with non-small cell lung cancer

圖 1 ALK在不同亞型肺腺癌中的表達(dá)情況及FISH驗證。A：ALK在乳頭型肺腺癌腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)高表達(dá)（×200）；B：ALK在實體型肺腺癌腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)高表達(dá)（×200）；C：ALK在腺泡型（篩狀型）肺腺癌腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)高表達(dá)（×200）；D：ALK IHC陽性腺泡型肺腺癌FISH檢測示腫瘤細(xì)胞核內(nèi)紅、綠信號分離或出現(xiàn)額外的紅色信號（箭頭示），提示ALK基因斷裂或重組，即陽性。Fig 1 Expression of ALK in 4 EGFR mutated lung adenocarcinomas with different histologic subtypes and the confirmation by FISH. A: High expression of ALK in cytoplasm of papillary predominant adenocarcinoma (×200); B: High expression of ALK in cytoplasm of solid predominant adenocarcinoma (×200); C: High expression of ALK in cytoplasm of acinar (cribriform) predominant adenocarcinoma (×200); D: In ALK IHC positive acinar predominant adenocarcinoma, the results of a break-apart FISH assay of tumor cells with separation of red and green probe signals or extra red probe signals (arrows) indicates a break of ALK or maybe chromosomal rearrangement involving ALK. The FISH result is positive.

2.4 525例肺癌患者中34例患者同時進(jìn)行了ALK FISH檢測及EGFR檢測的結(jié)果 34例患者中14例ALK（D5F3）為陽性，經(jīng)FISH驗證后，其中10例FISH亦為陽性。其中ALK IHC及FISH均陽性的病例多為腺癌，其亞型可為實體型、腺泡型及乳頭型（圖1）。34例患者按照EGFR的基因狀態(tài)劃分為EGFR野生型組及EGFR突變組，分別比較IHC陽性與FISH陽性的符合率（表2）。EGFR野生型組IHC 3+及IHC 1+與FISH陽性的吻合率均為100%，IHC 2+與FISH陽性吻合率為66.67%。EGFR突變組IHC 3+與FISH陽性吻合率為50%，IHC 1+與FISH陽性的吻合率為0。兩組患者合計后，IHC 3+與FISH陽性吻合率為88.71%，IHC 2+與FISH陽性吻合率為66.67%，IHC 1+與FISH陽性吻合率為50%。無論EGFR的基因狀態(tài)抑或兩組合計，IHC陰性與FISH陰性的吻合率均為100%。上述結(jié)果所表現(xiàn)出的趨勢與文獻(xiàn)相符[16]。

上述34例患者中有4例肺癌患者免疫組化ALK（D5F3）為陽性（圖2），2例為3+，另2例為1+，均為腺泡型腺癌。他們同時存在EGFR突變，包括3例19外顯子缺失突變，1例21外顯子L858R突變（表3）。對此4例ALK IHC患者進(jìn)行ALK FISH驗證，僅有1例陽性，為34歲男性，ALK IHC是蛋白表達(dá)為3+，F(xiàn)ISH檢測示紅、綠信號分離的細(xì)胞數(shù)超過了15%，達(dá)41%（圖2），同時存在EGFR 19外顯子的缺失。該患者已服用ALK-TKI，近期效果不錯。另外3例無論ALK IHC的表達(dá)水平為3+或1+，其ALK FISH 驗證均為陰性（圖2）。

3 討論

FISH是研究檢測ALK融合基因最早也是最公認(rèn)的方法[16]。通過熒光顯微鏡下的觀察，可以原位觀測到細(xì)胞核內(nèi)ALK基因的斷裂，間接提示ALK基因可能斷裂后與其他基因（如最常見的EML4，以及少見的TFG、KIF5B）相融合，異常激活下游的酪氨酸激酶，促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展[17]。由于用于FISH檢測的探針較為昂貴、熒光顯微鏡的特殊設(shè)備需求、暗視野的讀片以及FISH結(jié)果的判讀，可能使得FISH不易在我國病理科得到廣泛普及。隨著研究的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)D5F3、5A4等免疫組化抗體在肺癌的ALK蛋白表達(dá)的檢測中具有高度的敏感性和特異性[18]，由于經(jīng)濟(jì)、易操作在我國病理科開始得到推廣。雖然FISH及免疫組化不能明確ALK融合基因的類型，但分別從基因及蛋白水平反映了ALK的斷裂和表達(dá)，是檢測ALK陽性肺癌的重要手段。

圖 2 4例EGFR突變型肺腺癌中ALK蛋白的表達(dá)情況及FISH檢測情況。A：第1例腺泡型腺癌（EGFR 21外顯子點突變L858R），腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)ALK蛋白表達(dá)為3+（×400）；B：第2例腺泡型腺癌（EGFR 19外顯子缺失突變），腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)ALK蛋白表達(dá)為1+（×400）；C：第3例腺泡型腺癌（EGFR 19外顯子缺失突變），腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)ALK蛋白表達(dá)為1+（×400）；D：FISH檢測示第一例腺癌腫瘤細(xì)胞核內(nèi)分別標(biāo)記3’端及5’端的紅、綠信號相近或融合（箭頭示），提示ALK基因未發(fā)生斷裂，為ALK野生型，即陰性；E：第4例腺泡型（篩狀）腺癌，（EGFR 19外顯子缺失突變），腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)ALK蛋白表達(dá)為3+（×400）；F：FISH檢測示第4例腺癌腫瘤細(xì)胞核內(nèi)紅、綠信號分離（箭頭示），提示ALK基因斷裂或重組，即陽性。Fig 2 Expression of ALK protein and FISH detection in 4 EGFR mutated lung adenocarcinoma cases. A: High expression (3+) in the first case of acinar predominant lung adenocarcinoma with EGFR exon 21 l858R (×400); B: Low expression (1+) in the second case of acinar predominant lung adenocarcinoma with EGFR exon 19 deletion (×400); C: Low expression (1+) in the third acinar predominant lung adenocarcinoma with EGFR exon 19 deletion (×400); D: The results of a break-apart FISH assay of tumor cells from the first patient with close apposition or confusion of red and green probe signals (arrows) which hybridizes to the 3 region and 5 region of ALK gene seperately. It indicates and intact wild-type ALK without broken. The FISH result is negative; E: High expression (3+) in the fourth acinar (cribriform) predominant lung adenocarcinoma with EGFR exon 19 deletion (×400); F: The results of a break-apart FISH assay of tumor cells from the fourth patient with separation of red and green probe signals(arrows) indicates a break of ALK or maybe chromosomal rearrangement involving ALK. The FISH result is positive.

表 2 不同EGFR狀態(tài)的34例肺癌病例中ALK免疫組化與FISH結(jié)果的比較Tab 2 Comparison between ALK IHC and FISH results in 34 patients with lung cancer and different EGFR status

2013年6月中華病理學(xué)雜志發(fā)表了吳一龍教授及臨床、病理各行業(yè)專家共同制定的《中國間變性淋巴瘤激酶（ALK）陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識（2013版）》（后文簡稱《共識》）[6]，為我們的實際工作操作提供了指南。本研究應(yīng)用常規(guī)免疫組化方法，使用ALK（D5F3）抗體對525例肺癌進(jìn)行篩查，結(jié)果表明陽性患者傾向于年輕女性，與文獻(xiàn)[19]報道相符。525例肺癌包括了肺腺癌、鱗癌、腺鱗癌及除小細(xì)胞癌外的神經(jīng)內(nèi)分泌癌等等，總體陽性率為5.14%，與文獻(xiàn)報道相符。本研究發(fā)現(xiàn)ALK陽性的肺腺癌中分化差的實體型比ALK陰性組更常見，分化較好的腺泡型及貼壁型少見，此與文獻(xiàn)[15]報道相符。在文獻(xiàn)中提到的伴＞10%印戒細(xì)胞及伴粘液腺癌分化的特殊組織學(xué)亞型，在本研究的ALK陽性組與陰性組之間未顯示出明顯差異，可能與病例數(shù)較少有關(guān)。從另一個方面而言，不能根據(jù)組織學(xué)亞型的特點進(jìn)行篩選患者。本研究在鱗癌及腺鱗癌病例中亦有陽性病例檢出。上述研究結(jié)果提示ALK（D5F3）免疫組化可以作為一個可靠的篩查手段，其篩查的結(jié)果、分型的趨勢與文獻(xiàn)報道相符。本研究標(biāo)本類型以經(jīng)皮肺穿刺等小標(biāo)本為主，并包括胸水沉渣等細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，結(jié)果表明ALK（D5F3）免疫組化方法可以廣泛應(yīng)用于各類標(biāo)本，結(jié)果可靠；并能盡可能地減少漏診，提高ALK陽性病例的檢出率。

表 3 4例EGFR突變肺腺癌患者的臨床病理特征及ALK IHC及FISH檢測結(jié)果Tab 3 IHC and FISH detection of ALK in 4 lung adenocarcinoma patients with EGFR mutations

《共識》指出常規(guī)免疫組化無論陽性信號強弱如何，均應(yīng)通過FISH、RT-PCTR或Ventana免疫組化進(jìn)行最終驗證。本研究將525例中的34例肺癌標(biāo)本進(jìn)行了FISH檢測，并對免疫組化的陽性程度與FISH的符合率進(jìn)行了研究，結(jié)果表明IHC陰性者FSIH均為陰性，符合率達(dá)100%；免疫組化陽性程度越高，F(xiàn)ISH陽性的幾率越大；但無論陽性程度如何，均有FISH陰性，即免疫組化假陽性的可能。上述結(jié)果與文獻(xiàn)[16]相符。

EGFR在我國NSCLC中的突變率明顯高于高加索人，可達(dá)40%以上（亞洲人群腺癌突變率為51.4%）[20]。本研究中的34例患者同時進(jìn)行了ALK FISH檢測及EGFR檢測。過去人們認(rèn)為ALK融合基因與EGFR在NSCLC中是相互排斥的[7]，但近年來隨著EGFR及ALK檢測的推廣、檢測人群的增加，發(fā)現(xiàn)了EGFR與ALK雙突變的人群，并且發(fā)現(xiàn)這些患者可能會對EGFR-TKI或ALK-TKI有不同程度的療效[8,9]。對于病理科而言，EGFR與ALK的檢測對指導(dǎo)臨床靶向治療具有重要意義。一般情況患者EGFR檢測結(jié)果為陰性（野生型）時，再進(jìn)行ALK檢測，即所謂的通過EGFR狀態(tài)富集ALK檢測人群。但是由于EGFR與ALK雙突變的存在，應(yīng)用免疫組化的方法篩查ALK陽性病例可以防止漏掉陽性的患者，為患者的靶向治療提供更多的選擇機(jī)會，并且該方法更加經(jīng)濟(jì)、快捷。由于應(yīng)用ALK（D5F3）免疫組化進(jìn)行ALK篩查得到結(jié)果的速度比EGFR測序或ARMS法檢測要快，如果ALK免疫組化為陽性，患者可能會疑問是否還需要進(jìn)行EGFR檢測。我們的研究表明是需要的，理由之一是EGFR、ALK雙突變的存在，另一個理由是ALK免疫組化陽性必須進(jìn)行FISH或其他方法的驗證方可以認(rèn)為是確切的陽性。

本研究中有4例患者是ALK免疫組化陽性伴有EGFR突變，經(jīng)過FISH驗證只有1例EGFR患者ALK FISH陽性，是確切的EGFR、ALK雙突變患者。另外3例EGFR突變患者無論ALK免疫組化陽性著染的強度如何，ALK FISH檢測均為陰性。該結(jié)果提示FISH檢測在診斷ALK陽性肺癌及EGFR、ALK雙突變肺癌中具有非常重要的作用。

綜上所述，本研究應(yīng)用免疫組化的方法對525例肺癌ALK基因的蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)在年輕、女性、實體型腺癌中ALK的表達(dá)更為常見。同時發(fā)現(xiàn)了EGFR突變與ALK基因融合共同存在的病例。本研究結(jié)果提示了ALK（D5F3）免疫組化方法是一個很好的ALK篩查手段，陽性病例進(jìn)行ALK FISH驗證是保證ALK陽性肺癌診斷的重要環(huán)節(jié)。