PSGL—1+/—；IL—2—/—小鼠模型的構(gòu)建

楊揚等

[摘要] 目的 構(gòu)建PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型。 方法 將白介素2敲除（IL-2 KO）小鼠與P-選擇素糖蛋白配體-1敲除（PSGL-1 KO）小鼠雜交，剪尾提DNA后用PCR法檢測小鼠的基因型。 結(jié)果 IL-2 KO小鼠與PSGL-1 KO小鼠雜交三代后，PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型構(gòu)建成功。 結(jié)論 將IL-2 KO小鼠與PSGL-1 KO小鼠雜交三代后，成功建立了PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型。

[關(guān)鍵詞] P-選擇素糖蛋白配體-1；白介素-2；P-選擇素糖蛋白配體-1敲除小鼠；白介素-2敲除小鼠；動物模型

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）23-0007-03

[Abstract] Objective To construct the PSGL-1+/-；IL-2-/- mice model. Methods PSGL-1 KO mice were mated with IL-2 KO mice. Mice were genotyped by PCR after cut the tail and extracted DNA. Results After PSGL-1 KO mice being mated with IL-2 KO mice for three generations， PSGL-1+/-；IL-2-/- mice were obtained. Conclusion PSGL-1+/-；IL-2-/- mice are established through PSGL-1 KO mice being mated with IL-2 KO mice.

[Key words] PSGL-1；IL-2；PSGL-1 knockout mice；IL-2 knockout mice；Animal model

基因工程小鼠（genetically engineered mouse，GEM）是隨著細胞工程、分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因打靶、轉(zhuǎn)基因、嵌合體等技術(shù)對實驗小鼠基因組有目的的改造或修飾，使小鼠有特定的特性或生物表型，以研究基因的功能、調(diào)控機制及與其他基因的相互作用等[1]?；蚬こ绦∈筮€可以作為人類的疾病模型，如自發(fā)腫瘤模型、自發(fā)動脈粥樣硬化模型等，研究疾病的發(fā)病機制和藥物研究?；蚬こ绦∈蟀ɑ蚯贸∈蟆⒒蛱鎿Q小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠[2，3]。本實驗所用的兩種基因工程小鼠為基因敲除小鼠，分別是白細胞介素-2敲除小鼠（IL-2 KO mouse）和P-選擇素糖蛋白配體-1敲除小鼠（PSGL-1 KO mouse）。為了進一步研究白細胞介素-2和P-選擇素糖蛋白配體-1在炎癥、心血管及腫瘤疾病中的共同作用，將IL-2 KO 小鼠和PSGL-1 KO 小鼠雜交建立了PSGL-1基因敲除及IL-2為雜合子的PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型?？梢栽倮么诵∈竽Ｐ徒⒏鞣N炎癥、心血管及腫瘤等疾病模型，所以此模型可作為研究PSGL-1和IL-2在炎癥、心血管和腫瘤中作用及相互關(guān)系的良好動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 實驗動物及飼養(yǎng) P-選擇素糖蛋白配體-1敲除小鼠（PSGL-1 KO小鼠）和白介素-2敲除小鼠（IL-2 KO小鼠）購自美國Jackson實驗室，共4只，雌雄各2只，周齡6～8周。小鼠在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，動物房溫度控制在22℃～28℃，濕度為50%～70%，并且保持12 h明/12 h暗。小鼠的飼料購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心并經(jīng)60Co輻照滅菌的全營養(yǎng)飼料。飲用水高壓滅菌。實驗設(shè)計時間為2013年6月～2014年3月。

1.1.2 試劑 PCR引物由廣州英駿公司合成，蛋白酶K及dNTP購自Sigma公司，Taq酶、Tris飽和酚及氯仿從廣州康龍公司訂購。

1.2 方法

1.2.1 IL-2基因的鑒定 突變型IL-2引物的序列：TCG AAT TCG CCA ATG ACA AGA CGC T；野生型IL-2引物的序列：CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT；通用引物序列：GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C。PCR反應(yīng)條件：94℃變性3 min，94℃ 30 s，64℃ 45 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)，72℃2 min充分延伸。在500 bp處有一條帶為IL-2純合子的小鼠，在342 bp處有一條帶為野生型小鼠，在500 bp和324 bp處各有一條帶為雜合子小鼠。

1.2.2 PSGL-1基因的鑒定 野生型PSGL-1基因引物序列：P1：5'-TCAAAA TC GTCATCCCCAAC -3，P2：5'-AGCTTCCTT GTGCTGCTGAC -3''；突變型PSGL-1基因引物序列：P1：5'-CCTT CTAT CGCC TTCT TGA CG-3'，P2：5'-TCAAAA TCGTCA TCCCCAAC-3'。PCR反應(yīng)的條件：94℃變性5 min，94℃30 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)35次；72℃延伸2 min。PSGL-1基因敲除的純合子小鼠在500 bp處有一條帶，PSGL-1基因為雜合子的小鼠在140 bp和500 bp處各有一條帶。

1.2.3 PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型的構(gòu)建 用IL-2 KO 雄性小鼠與PSGL-1 KO雌性小鼠雜交，第一代小鼠PSGL-1和IL-2基因均為雜合子，用PSGL-1+/-；IL-2+/-雄性小鼠與IL-2 KO雌性小鼠或者用PSGL-1+/-；IL-2+/-雌性小鼠與IL-2 KO雄性小鼠再進行雜交，在第二代可得到PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠。endprint

2 結(jié)果

2.1 IL-2 KO小鼠與PSGL-1 KO小鼠雜交情況

IL-2 KO 雄性小鼠與PSGL-1 KO雌性小鼠以1∶2的比例雜交兩籠，所生小鼠IL-2和PSGL-1基因全部為雜合子，共獲得24只。用第一代小鼠與IL-2 KO 小鼠雜交，第二代共獲得小鼠136只，其中PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠38只。

2.2 PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠的鑒定結(jié)果

把PSGL-1 KO小鼠和IL-2 KO小鼠雜交，在第三代小鼠中，1、3號和4號小鼠為PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠，2號小鼠為PSGL-1+/-；IL-2+/-小鼠。圖1A中的5號小鼠為PSGL-1基因的陽性對照，圖1B中的5號小鼠為IL-2基因的陽性對照。

3討論

白介素-2（IL-2）是由Morgan等在1976年發(fā)現(xiàn)的由T淋巴細胞分泌的一種因子，主要由活化的Ⅰ型輔助淋巴細胞分泌，主要功能是刺激T細胞的增生，促進T細胞的增殖；還促進NK細胞和B細胞的活化、增殖；促進細胞毒性T淋巴細胞的產(chǎn)生和增殖等[4-6]。白介素-2還可以促使NK細胞、T淋巴細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子和干擾素等，而且目前已廣泛應(yīng)用于抗炎和抗腫瘤治療[7-10]。

P-選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1， PSGL-1）是一種粘附分子，在幾乎所有類型的白細胞表面表達，是選擇素的配體[11-14]。因此，PSGL-1與表達于白細胞的L-選擇素及表達于活化的血管內(nèi)皮細胞的E-選擇素和P-選擇素相互作用，從而介導(dǎo)白細胞的黏附[15，16]。由于白細胞黏附與炎癥、凝血、傷口修復(fù)及腫瘤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，因此PSGL-1介導(dǎo)的白細胞黏附作用可在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用。

IL-2敲除小鼠是由Ivan Horak等在1991年構(gòu)建成功的，IL-2純合子敲除小鼠在4～9周時會出現(xiàn)脾、淋巴結(jié)腫大、腸道炎癥及貧血等疾病的癥狀。由于白介素-2與PSGL-1在炎癥、腫瘤等疾病中都發(fā)揮重要作用，為了探索兩者是否具有協(xié)同或拮抗作用，本實驗將白細胞介素-2敲除小鼠和黏附分子P-選擇素糖蛋白配體基因敲除小鼠雜交建立了PSGL-1基因敲除及IL-2為雜合子的PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型，在飼養(yǎng)的過程中，由于PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠的免疫力會降低，易感染，因此在飼養(yǎng)的過程中對無菌的要求會更加嚴格，小鼠必須飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，飲用水及飼料必須是無菌的?？梢岳么诵∈竽Ｐ徒⒏鞣N炎癥、心血管、自身免疫性疾病及腫瘤模型，也為研究PSGL-1和IL-2在炎癥、心血管和腫瘤疾病中的作用及相互關(guān)系提供了良好的動物模型。

[參考文獻]

[1] Watson AL，Anderson LK，Greeley AD，et al. Co-targeting the MAPK and PI3K/AKT/mTOR pathways in two genetically engineered mouse models of schwann cell tumors reduces tumor grade and multiplicity[J]. Oncotarget， 2014，5（6）：1502-1514.

[2] 寧磊，王保寧. 基因工程小鼠研究現(xiàn)狀[J]. 青海科技，2000， 7：46-47.

[3] Nomura T. Practical development of genetically engineered animals as human disease models[J]. Lab Anim Sci，1997，47（2）：113-117.

[4] Okeke EB1，Okwor I，Mou Z， et al. CD4+CD25+ regulatory T cells attenuate lipopolysaccharide-induced systemic inflammatory responses and promotes survival in murine Escherichia coli infection[J]. Shock，2013，40（1）：65-73.

[5] Heemskerk B， Liu K， Dudley ME， et al. Adoptive cell therapy for patients with melanoma， using tumor-infiltrating lymphocytes genetically engineered to secrete interleukin-2[J]. Hum Gene Ther， 2008，19（5）：496-510.

[6] Gardner PJ，Joshi L，Lee RW，et al. SIRT1 activation protects against autoimmune T cell-driven retinal disease in mice via inhibition of IL-2/Stat5 signaling[J]. J Autoimmun， 2013，42：117-129.

[7] Hao J1， Liu R， Piao W， et al. Central nervous system （CNS）-resident natural killer cells suppress Th17 responses and CNS autoimmune pathology[J]. J Exp Med， 2010，207（9）：1907-1921.

[8] 徐世新， 姚舒， 陸淑鳳. 重組白介素2聯(lián)合卡鉑胸腔內(nèi)灌注治療惡性胸腔積液臨床觀察[J]. 中國當(dāng)代醫(yī)藥，2010，17（34）：68-69.endprint

[9] 楊林，王金萬，孫燕. 重組人新型白介素-2治療晚期腫瘤Ⅱ期臨床研究[J]. 中國腫瘤生物治療雜志，2001，8（4）：277-280.

[10] 劉大勇，冀成山， 郝鴻澤. 腔內(nèi)注入重組白介素-2治療肺癌惡性心包積液30例臨床觀察[J]. 心肺血管病雜志，2011，30（1）：75-76.

[11] Hoos A， Protsyuk D， Borsig L. Metastatic growth progression caused by PSGL-1-mediated recruitment of monocytes to metastatic sites[J]. Cancer Res， 2014，74（3）：695-704.

[12] Banks JM，Herman CT，Bailey RC. Bromelain decreases neutrophil interactions with P-selectin，but not E-selectin，in vitro by proteolytic cleavage of P-selectin glycoprotein ligand-1[J]. PLoS One，2013，8（11）：e78988.

[13] Stadtmann A，Germena G，Block H，et al. The PSGL-1-L-selectin signaling complex regulates neutrophil adhesion under flow[J]. J Exp Med，2013，210（11）：2171-2180.

[14] Lo CY，Antonopoulos A，Dell A，et al. The use of surface immobilization of P-selectin glycoprotein ligand-1 on mesenchymal stem cells to facilitate selectin mediated cell tethering and rolling[J]. Biomaterials，2013，34（33）：8213-8222.

[15] Moore KL，Stults NL，Diaz S，et al. Identification of a specific glycoprotein ligand for P-selectin（CD62）on myeloid cells[J]. J Cell Biol，1992，118（2）：445-456.

[16] McEver RP，Cummings RD. Role of PSGL-1 binding to selectins in leukocyte recruitment[J]. J Clin Invest，1997， 100（11）：S97-103.

（收稿日期：2014-04-14）endprint

[9] 楊林，王金萬，孫燕. 重組人新型白介素-2治療晚期腫瘤Ⅱ期臨床研究[J]. 中國腫瘤生物治療雜志，2001，8（4）：277-280.

[10] 劉大勇，冀成山， 郝鴻澤. 腔內(nèi)注入重組白介素-2治療肺癌惡性心包積液30例臨床觀察[J]. 心肺血管病雜志，2011，30（1）：75-76.

[11] Hoos A， Protsyuk D， Borsig L. Metastatic growth progression caused by PSGL-1-mediated recruitment of monocytes to metastatic sites[J]. Cancer Res， 2014，74（3）：695-704.

[12] Banks JM，Herman CT，Bailey RC. Bromelain decreases neutrophil interactions with P-selectin，but not E-selectin，in vitro by proteolytic cleavage of P-selectin glycoprotein ligand-1[J]. PLoS One，2013，8（11）：e78988.

[13] Stadtmann A，Germena G，Block H，et al. The PSGL-1-L-selectin signaling complex regulates neutrophil adhesion under flow[J]. J Exp Med，2013，210（11）：2171-2180.

[14] Lo CY，Antonopoulos A，Dell A，et al. The use of surface immobilization of P-selectin glycoprotein ligand-1 on mesenchymal stem cells to facilitate selectin mediated cell tethering and rolling[J]. Biomaterials，2013，34（33）：8213-8222.

[15] Moore KL，Stults NL，Diaz S，et al. Identification of a specific glycoprotein ligand for P-selectin（CD62）on myeloid cells[J]. J Cell Biol，1992，118（2）：445-456.

[16] McEver RP，Cummings RD. Role of PSGL-1 binding to selectins in leukocyte recruitment[J]. J Clin Invest，1997， 100（11）：S97-103.

（收稿日期：2014-04-14）endprint

[9] 楊林，王金萬，孫燕. 重組人新型白介素-2治療晚期腫瘤Ⅱ期臨床研究[J]. 中國腫瘤生物治療雜志，2001，8（4）：277-280.

[10] 劉大勇，冀成山， 郝鴻澤. 腔內(nèi)注入重組白介素-2治療肺癌惡性心包積液30例臨床觀察[J]. 心肺血管病雜志，2011，30（1）：75-76.

[11] Hoos A， Protsyuk D， Borsig L. Metastatic growth progression caused by PSGL-1-mediated recruitment of monocytes to metastatic sites[J]. Cancer Res， 2014，74（3）：695-704.

[12] Banks JM，Herman CT，Bailey RC. Bromelain decreases neutrophil interactions with P-selectin，but not E-selectin，in vitro by proteolytic cleavage of P-selectin glycoprotein ligand-1[J]. PLoS One，2013，8（11）：e78988.

[13] Stadtmann A，Germena G，Block H，et al. The PSGL-1-L-selectin signaling complex regulates neutrophil adhesion under flow[J]. J Exp Med，2013，210（11）：2171-2180.

[14] Lo CY，Antonopoulos A，Dell A，et al. The use of surface immobilization of P-selectin glycoprotein ligand-1 on mesenchymal stem cells to facilitate selectin mediated cell tethering and rolling[J]. Biomaterials，2013，34（33）：8213-8222.

[15] Moore KL，Stults NL，Diaz S，et al. Identification of a specific glycoprotein ligand for P-selectin（CD62）on myeloid cells[J]. J Cell Biol，1992，118（2）：445-456.

[16] McEver RP，Cummings RD. Role of PSGL-1 binding to selectins in leukocyte recruitment[J]. J Clin Invest，1997， 100（11）：S97-103.

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