高效液相色譜法同時檢測藥渣中四環(huán)素及其衍生物

王敏等

摘要：建立了藥渣中四環(huán)素及其衍生物殘留的高效液相色譜檢測方法。樣品經(jīng)pH 4.0的EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取后，用Agilent HC-C18色譜柱，以甲醇：乙腈（1∶2，V/V），含0.01 mol/L草酸為流動相，梯度洗脫，流速0.8 mL/min，檢測波長300 nm。結(jié)果表明，方法檢出限為0.05～0.10 mg/L，在0.1～100.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加標回收率為85.8%～100.5%。該方法簡便、快速、準確、選擇性好，適用于藥渣中四環(huán)素及其衍生物的定性定量分析。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；四環(huán)素及其衍生物；四環(huán)素藥渣

中圖分類號：Q815 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）06-1411-04

Simultaneous Determination of Tetracycline and Its Derivatives in Tetracycline Waste with HPLC

WANG Min1，2，MA Yu-long1，2，MA Lin1，2，WANG Yan1，2，SI Ji-tao1

（1.College of Chemistry and Chemical Engineering， Ningxia University， Yinchuan 750021，China；

2.Ningxia Engineering Research Center for Natural Medicine， Yinchuan 750021，China）

Abstract： A high performance liquid chromatographic method （HPLC） was developed to detect tetracycline and its derivatives in tetracycline waste. The samples were extracted with EDTA-Mcllvaine buffer group（pH 4.0）. Tetracycline and its derivatives were successfully separated on Agilent HC-C18 column using methanol-acetonitrile（1∶2， V/V） containing 0.01 mol/L oxalic acid as mobile phase at a flow rate of 0.8 mL/min and were detected at 300 nm. The results showed that the limit of detection was 0.05～0.10 mg/L. The linear range was from 0.1 mg/L to 100.0 mg/L. The recoveries were from 85.8% to 100.5%. It was simple， rapid， accurate and selective for detecting tetracycline and its from derivatives in tetracycline waste or feed.

Key words： HPLC； tetracycline and its derivatives； tetracycline waste

四環(huán)素抗菌譜廣、價格低廉，廣泛應(yīng)用于動物疾病的治療、預(yù)防[1]。但同時在四環(huán)素生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量廢棄藥渣，藥渣是生產(chǎn)四環(huán)素的過程中發(fā)酵醪液經(jīng)過濾提取后剩余的濾渣，其主要成分包括菌絲體、剩余培養(yǎng)基、代謝產(chǎn)物及少量的四環(huán)素[2]。這些藥渣中雖含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，但也有四環(huán)素殘留，極大地限制了其資源利用。四環(huán)素不穩(wěn)定，經(jīng)光照易分解成其衍生物差向四環(huán)素或脫水四環(huán)素等。差向四環(huán)素及脫水四環(huán)素藥效極低或沒有，其毒副作用較大，已經(jīng)被歐盟確定為四環(huán)素的殘留標識物[3]。發(fā)酵過程產(chǎn)生的廢棄藥渣目前已成為造成環(huán)境中四環(huán)素及其衍生物增加、耐藥菌泛濫的主要原因之一[4]，被列為危險固體廢棄物，許多國家對經(jīng)處理或再利用后藥渣的排放均有嚴格的殘留限制和規(guī)定。因此，建立一種準確快速的四環(huán)素及其衍生物殘留檢測方法，對于四環(huán)素藥渣的再處理及環(huán)境保護具有重要意義。

目前，四環(huán)素檢測主要有微生物法[5]、薄層色譜法[6]、免疫分析法[7]、高效液相色譜法[8-10]以及液質(zhì)聯(lián)用法[11，12]，但關(guān)于四環(huán)素及其衍生物同時檢測報道甚少。本研究主要采用高效液相色譜法同時檢測藥渣中殘留的四環(huán)素及其衍生物，為四環(huán)素藥渣再利用及環(huán)境殘留監(jiān)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四環(huán)素藥渣由某四環(huán)素生產(chǎn)企業(yè)提供。

鹽酸四環(huán)素（Sigma公司，純度98%）、差向四環(huán)素（對照品，中國藥品檢驗所）、脫水四環(huán)素（對照品，中國藥品檢驗所）；甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純試劑；去離子水。

1.2 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津）；H-1850型離心機（湖南湘儀）；UV-1750型紫外可見分光光度計（日本島津）；0.22 μm型聚四氟乙烯微孔濾膜。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制 稱取10 mg四環(huán)素（TC）、差向四環(huán)素（ETC）、脫水四環(huán)素（ATC），加入少量的甲醇溶解，然后轉(zhuǎn)移至25 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，4 ℃避光保存。準確移取各標準儲備液，用棕色容量瓶配制各種濃度的混合標準溶液，0.22 μm濾膜過濾，4 ℃避光保存。

EDTA-Mcllvaine緩沖提取液：稱取檸檬酸（含1個結(jié)晶水）12.9 g，Na2HPO4·2H2O 10.9 g，EDTA3.72 g，用去離子水溶解并定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至4.00±0.05。

1.3.2 前處理方法 稱取試樣0.5 g（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中，用10 mL提取液溶解，超聲10 min，6 000 r/min離心10 min后，取上清液，殘渣再加入10 mL提取液超聲處理，離心后合并上清液，用棕色容量瓶定容至100 mL，0.22 μm濾膜過濾，濾液4 ℃避光保存，待測。

1.3.3 分析方法 分別取四環(huán)素（TC）、差向四環(huán)素（ETC）以及脫水四環(huán)素（ATC）標準溶液在200～450 nm波長下掃描，獲取特征波長，以最大吸收波長為檢測波長。

本試驗采用Agilent HC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-甲醇（2∶1，V/V）-草酸溶液（0.01 mol/L）為流動相，流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃時，考察有機相比例對四環(huán)素、差向四環(huán)素以及脫水四環(huán)素保留時間及峰型的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

四環(huán)素（TC）、差向四環(huán)素（ETC）以及脫水四環(huán)素（ATC）標準溶液的紫外-可見光譜圖見圖1。由圖1可知，TC在350 nm有最大吸收，ATC在300 nm和430 nm有最大吸收峰，ETC在375和295 nm吸收最大，即：在300 nm處ATC、TC、ETC均有較大吸收，故選擇300 nm為檢測波長。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 有機相體積配比的選擇 以乙腈-甲醇（2∶1，V/V）-草酸溶液（0.01 mol/L）為流動相，考察了流動相中有機相體積配比（20%～35%，V/V）對TC及其衍生物保留時間及分離度的影響。由圖2可知，隨著有機相體積配比的增大，流動相的極性逐漸降低，各化合物的保留時間減少。當有機相比例為25%時，3種四環(huán)素均能得到分離，但脫水四環(huán)素的峰型不好且出峰時間較長，不利于其快速檢測；當有機相比例增大到35%時，脫水四環(huán)素的峰型好且出峰時間縮短，但四環(huán)素、差向四環(huán)素保留時間接近，因此本試驗采取梯度洗脫。圖3，圖4分別為該條件下標準品及樣品的色譜圖。

2.3 提取條件的優(yōu)化

四環(huán)素類抗生素在醇類中的溶解度較大，在乙酸乙酯、乙腈、丙酮等溶劑中溶解度較小，易被色譜柱上殘存的硅醇基吸附且易與金屬離子形成螯合物[13，14]，而EDTA能夠抑制四環(huán)素類抗生素與硅醇基的吸附及與金屬離子的螯合，且超聲可以促進藥渣的溶解。因此，本研究分別選取甲醇和EDTA-Mcllvaine緩沖溶液作為提取劑，比較了超聲和直接提取的效果，結(jié)果如圖5所示。超聲提取回收率均高于直接提取，甲醇提取的回收率高于EDTA-Mcllvaine緩沖液，但由于甲醇提?。▓D6）的雜質(zhì)較多，不利于目標化合物的準確定量，因此試驗采取EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取。

2.4 線性關(guān)系與檢測限

分別移取適量3種四環(huán)素的標準儲備液，配制成0.1、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0 mg/L系列濃度的混合標準品溶液，按上述確定的色譜條件分別進樣20 μL。以3種四環(huán)素標準品的質(zhì)量濃度X（mg/L）對峰面積Y線性擬合，3種組分線性方程見表1，以3倍信噪比求出檢出限，以10倍信噪比求得定量限。由結(jié)果可知，峰面積與質(zhì)量濃度范圍在0.1～100.0 mg/L呈良好線性關(guān)系，檢出限為0.05～0.10 mg/L，定量限為0.163～0.330 mg/L。

2.5 樣品測定

稱取四環(huán)素藥渣0.5 g，平行5份，按上述提取方法及色譜條件測定藥渣中3種四環(huán)素，并由標準曲線計算其含量，藥渣樣品中TC、ETC和ATC的平均含量分別為23.6、20.5、2.8 mg/L。

2.6 精密度和回收率

稱取已知含量的四環(huán)素藥渣0.5 g，分別添加低、中、高3個濃度水平的混合標準溶液，按上述提取方法及色譜條件進行回收率試驗，每個添加濃度取5個平行樣。回收率測定結(jié)果如表2所示。

3 結(jié)論

選用EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取四環(huán)素、差向四環(huán)素及脫水四環(huán)素，回收率為85.8%～100.5%。高效液相色譜分析時，用甲醇-乙腈-草酸溶液0.01 mol/L為流動相，采用梯度洗脫的方式，使四環(huán)素類抗生素可在20 min內(nèi)分離。該方法簡便、快速、靈敏度高、選擇性好，適用于藥渣中四環(huán)素及其衍生物的定性定量分析。

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