生物素-鏈霉親和素介導(dǎo)受體靶向卵巢癌SKOV3細(xì)胞量子點(diǎn)體外成像的研究*

聶麗菊 許恒毅 葉稱(chēng)連 黃小林 劉雯婷 傅 芬

·基礎(chǔ)研究·

生物素-鏈霉親和素介導(dǎo)受體靶向卵巢癌SKOV3細(xì)胞量子點(diǎn)體外成像的研究*

聶麗菊①②許恒毅②葉稱(chēng)連①黃小林②劉雯婷①傅 芬①

目的：研制一種生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）介導(dǎo)葉酸受體（FR）靶向量子點(diǎn)（QD）熒光探針，初步驗(yàn)證其靶向性及信號(hào)放大效應(yīng)。方法：采用活潑酯法，將鏈霉親和素（SA）與QD共價(jià)偶聯(lián)制備QD-SA并對(duì)其物理特性進(jìn)行驗(yàn)證；采用活潑酯法以牛血清蛋白為載體合成生物素化葉酸（FA）。通過(guò)生物素化FA與QD-SA結(jié)合制備BAS介導(dǎo)葉酸受體（FR）靶向QD探針，比較該探針對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞及FR表達(dá)陰性的肺癌A549細(xì)胞的識(shí)別情況，并驗(yàn)證其靶向特異性；對(duì)比該探針在生物素化FA孵育1、4 h時(shí)成像的效果；比較該探針與未經(jīng)BAS介導(dǎo)的QD-FA探針在不同孵育時(shí)間對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞成像的差異。結(jié)果：BAS介導(dǎo)FR靶向QD探針可特異性識(shí)別FR表達(dá)陽(yáng)性的卵巢癌SKOV3細(xì)胞，且孵育4 h較1 h熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，同等條件下其產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度較未經(jīng)BAS介導(dǎo)的QD-FA探針明顯增強(qiáng)。結(jié)論：制備了一種特異性好、靈敏度高的BAS介導(dǎo)FR靶向QD探針，該探針在卵巢癌早期診斷方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

生物素-鏈霉親和素 葉酸 量子點(diǎn) 卵巢癌細(xì)胞 體外成像

卵巢癌是婦科常見(jiàn)惡性腫瘤，雖其發(fā)病率位于女性生殖系統(tǒng)腫瘤中第3位，但病死率卻居于首位。大多數(shù)卵巢癌被確診時(shí)已是晚期，其5年生存率僅為30%，研究表明早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌可使其5年生存率增長(zhǎng)至92%［1］。因此，早期診斷和治療卵巢癌是改善患者預(yù)后提高其生存率的重要因素［2］。目前臨床上常規(guī)診斷卵巢癌方法為經(jīng)陰道超聲、磁共振成像、實(shí)驗(yàn)室腫瘤標(biāo)記物和組織學(xué)檢查等，這些方法通常難以滿(mǎn)足臨床對(duì)卵巢癌早期精確診斷的需求。研究表明癌癥患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的出現(xiàn)早于可見(jiàn)的實(shí)體瘤［3］，因此，尋找特異性靶向卵巢癌細(xì)胞的生物探針是目前研究的熱點(diǎn)［4］。量子點(diǎn)（quantum dot，QD）是一種新型半導(dǎo)體納米晶體，具有熒光量子效率高、光化學(xué)穩(wěn)定性好以及不會(huì)發(fā)生光漂白作用等優(yōu)點(diǎn)［5］，可結(jié)合抗體、多肽等制備高性能的熒光探針，靶向腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷［6-7］。由于葉酸受體（folate receptor，F(xiàn)R）在卵巢癌細(xì)胞表面表達(dá)高為95%［8］，當(dāng)葉酸（folic acid，F(xiàn)A）與QD偶聯(lián)制成生物熒光探針后，可通過(guò)FA與FR的高親和力（Kd為0.19 nM［9］）結(jié)合，將QD高效富集在腫瘤細(xì)胞表面，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的特異性靶向成像。然而，葉酸分子量小，直接連接到QD表面后，其分子結(jié)構(gòu)及其結(jié)合活性基團(tuán)可能被改變，影響其生物活性。因此，本研究使用生物素-親和素系統(tǒng)（biotin-avidin system，BAS），介導(dǎo)QD與FA偶聯(lián)制備BAS介導(dǎo)FR靶向QD探針。利用該探針同時(shí)檢測(cè)卵巢癌SKOV3細(xì)胞及肺癌A549細(xì)胞，驗(yàn)證其靶向特異性，對(duì)比該探針與未經(jīng)BAS介導(dǎo)的QD-FA探針在卵巢癌SKOV3細(xì)胞成像中的差異，以明確BAS的信號(hào)放大作用。本研究旨在建立一種快速、特異、高效靶向卵巢癌細(xì)胞成像方法，為卵巢癌早期診斷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

羧基化水溶性QD購(gòu)自美國(guó)Ocean NanoTech公司；QD-FA由本課題組前期合成；生物素氨己基-N-羥基丁二酰亞胺活性酯、鏈霉親和素（streptavidin，SA）購(gòu)自上海華藍(lán)化學(xué)公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)自韓國(guó)BIOSHARP公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；1-乙基-3-［3-二甲基氨基丙基］碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N，N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，其他試劑為分析純；卵巢癌SKOV3細(xì)胞由江西省南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心饋贈(zèng)；12孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自江蘇海門(mén)博洋實(shí)驗(yàn)器材廠；直熱式CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific公司；倒置熒光顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 QD-SA的合成及其物理特性驗(yàn)證 采用活潑酯法將QD表面的羧基與SA的氨基共價(jià)結(jié)合形成QD-SA，其合成方法參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。具體如下：取100 μL QDs（濃度為8 μM）溶于pH為5.5的100 μL的硼酸緩沖液（borate buffer，BB）中，按照QD∶EDC摩爾比1∶1 000，QD∶NHS摩爾比為1∶2 000分別加入EDC/NHS，室溫反應(yīng)5～10 min。調(diào)整溶液pH至8～8.5，加入SA 1.056 mg，持續(xù)混勻2 h后，加入10 μL含5% BSA的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）封閉10 min終止反應(yīng)。QD-SA復(fù)合物10 000 r/min離心，離心5 min，除去沉淀，使用pH為7的2 mL BB在100 K超濾管中洗滌，最后重懸于pH為7的0.1 mL BB中并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其偶聯(lián)效果。此外，采用動(dòng)態(tài)光散射分析儀及透射電子顯微鏡對(duì)QD偶聯(lián)前后物理性質(zhì)進(jìn)行分析，以了解其特性改變。

1.2.2 生物素化FA的合成 首先將FA與BSA結(jié)合，再與生物素結(jié)合制備生物素化FA。1）FA-PEG-NH2的偶聯(lián)：FA 6 mg溶解于600 μL二甲基亞砜中，加入DCC 3 mg、NHS 3 mg及三乙胺60 μL共同暗室反應(yīng)4 h，加入雙氨基聚乙二醇30 mg暗室反應(yīng)過(guò)夜；反應(yīng)完全后離心，使用-20℃丙酮沉淀，乙酸乙酯洗滌3次，置于通風(fēng)柜中干燥并避光保存。2）FA-PEG-BSA的偶聯(lián)：FA-PEG-NH25 mg、EDC 2.5 mg、NHS 2.5 mg溶于pH為7的500 μL BB中，共同室溫反應(yīng)10 min；加入BSA 8.35 mg，室溫反應(yīng)2 h，透析純化3次后于4℃冰箱保存。3）生物素化FA的制備：長(zhǎng)鏈生物素∶FA-PEG-BSA摩爾比為20∶1混合后室溫孵育30 min，將混合溶液于4℃超純水透析3 d，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 BAS介導(dǎo)FR靶向QD在卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外成像中的應(yīng)用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌SKOV3細(xì)胞及肺癌A549細(xì)胞，接種于12孔板內(nèi)，細(xì)胞約1×106/mL。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h；吸棄所有孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌1次后加入生物素化FA（對(duì)照組不加）分別孵育1、4 h；PBS洗滌后加入QD-SA（QD-SA∶生物素化FA為1∶20）共孵育30 min；PBS洗滌3次后加入適量DAPI核染料，室溫反應(yīng)20 min；使用PBS洗凈并重懸，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色結(jié)果。此外，將孵育的卵巢癌SKOV3細(xì)胞分為加入生物素化FA組、未加入組，共同孵育4 h，PBS洗凈后分別加入QD-SA及QD-FA反應(yīng)30、60 min，隨后用PBS洗凈，加入DAPI，其余操作同前，以驗(yàn)證BAS的信號(hào)放大效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 BAS介導(dǎo)FR靶向QD探針捕獲卵巢癌細(xì)胞的原理

BAS是一種新型生物標(biāo)記技術(shù)，將SA修飾的QD與BSA介導(dǎo)合成的生物素化FA結(jié)合，可明顯增加細(xì)胞表面FR結(jié)合FA的數(shù)目，使更多的QD靶向在細(xì)胞表面，增強(qiáng)熒光信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度，從而實(shí)現(xiàn)快速、特異、高效靶向卵巢癌細(xì)胞成像（圖1）。

2.2 QD-SA的物理特性驗(yàn)證

2.2.1 QD-SA的性質(zhì) 本實(shí)驗(yàn)制備的QD-SA在常溫下為澄清的紅色溶液。動(dòng)態(tài)光散射分析（圖2A）表明其水化粒徑分布較集中，平均為（25.5±0.6）nm，Zeta電位為（-48.2±5.3）mv，透射電子顯微鏡顯示（圖2B）該粒子大小均一，平均為（9±0.5）nm。

2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳 電泳遷移率主要取決于分子大小、介質(zhì)粘度及顆粒所帶電荷。QD及QD-SA在凝膠電泳中均能由陰電極向陽(yáng)電極泳動(dòng)，但QD（左側(cè)）的遷移率明顯快于QD-SA（右側(cè)）。這是由于在同等電泳條件下QD偶聯(lián)SA后，形成的QD-SA粒徑較QD增大，其表面負(fù)電荷也由于羧基與SA表面氨基的反應(yīng)消耗而較QD表面負(fù)電荷少，因此在電場(chǎng)中QD-SA由陰電極向陽(yáng)電極泳動(dòng)的速度較QD更慢（圖2C）。

2.3 BAS介導(dǎo)FR靶向QD捕獲卵巢癌SKOV3細(xì)胞

2.3.1 BAS介導(dǎo)FR靶向QD捕獲卵巢癌SKOV3細(xì)胞及肺癌A549細(xì)胞熒光強(qiáng)度對(duì)比 未經(jīng)生物素化FA孵育及QD-SA反應(yīng)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞膜表面未見(jiàn)熒光（圖3A），而經(jīng)生物素化FA孵育后的卵巢癌SKOV3細(xì)胞在加入QD-SA后，細(xì)胞膜表面均可見(jiàn)較強(qiáng)的熒光，其中孵育4 h時(shí)尤為明顯（圖3B、3C）。此外，只加有QD-SA反應(yīng)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞及經(jīng)生物素化FA孵育4 h再加入QD-SA反應(yīng)的肺癌A549細(xì)胞膜表面均未見(jiàn)明顯熒光（圖3D、3E）。表明BAS介導(dǎo)FR靶向QD可特異性識(shí)別FR表達(dá)陽(yáng)性的卵巢癌SKOV3細(xì)胞，且隨著FA與細(xì)胞孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)A與細(xì)胞表面FR結(jié)合數(shù)量增加，進(jìn)而產(chǎn)生的熒光信號(hào)也增強(qiáng)。

2.3.2 QD-FA與BAS介導(dǎo)FR靶向QD捕獲卵巢癌SKOV3細(xì)胞的熒光強(qiáng)度對(duì)比 QD-FA與BAS介導(dǎo)FR靶向QD共同捕獲細(xì)胞時(shí)，在相同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，QD-FA所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度明顯偏弱，而隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各細(xì)胞膜表面的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（圖4）。

圖1 QD-FA與BAS介導(dǎo)FR靶向QD探針捕獲卵巢癌SKOV3細(xì)胞原理圖Figure 1 Schematic of QD-FA and BAS-mediated FR-targeted QD probe for capturing SKOV3 cells

圖2 QD-SA的物理特性驗(yàn)證圖Figure 2 Physical characteristics of QD-SA

圖3 BAS介導(dǎo)FR靶向QD及QD-SA識(shí)別卵巢癌SKOV3細(xì)胞及肺癌A549細(xì)胞熒光強(qiáng)度比較Figure 3 Comparison of fluorescent intensity between BAS-mediated FR-targeted QD and QD-SA probes in recognizing SKOV3 and A549 cells

圖4 QD-FA及BAS介導(dǎo)FR靶向QD識(shí)別卵巢癌SKOV3細(xì)胞熒光強(qiáng)度比較Figure 4 Comparison of fluorescent intensity between BAS-mediated FR-targeted QD and QD-FA probes in recognizing SKOV3 cells

卵巢癌起病隱匿、進(jìn)展迅速，最主要的死亡原因是轉(zhuǎn)移的發(fā)生，腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多步驟多因素的復(fù)雜過(guò)程。臨床通常將具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)病灶，以極少的數(shù)量轉(zhuǎn)移到血液、骨髓、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處器官稱(chēng)為腫瘤的微轉(zhuǎn)移［11］。實(shí)體惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)晚期事件，而腫瘤的侵襲和微轉(zhuǎn)移是早期事件。如果能夠在發(fā)現(xiàn)可見(jiàn)實(shí)體瘤之前檢查出外周血中極少量的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，對(duì)于輔助醫(yī)生進(jìn)行腫瘤早期確診以及對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化治療具有十分重要的意義。

BAS是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中具有最強(qiáng)親和力的物質(zhì)，其中SA由4條序列相同的肽鏈組成，每條肽鏈均能結(jié)合1個(gè)生物素分子，可同時(shí)以多價(jià)形式結(jié)合生物素化的大分子和標(biāo)記物［12］，具有極佳的靈敏性、特異性及生物相容性。本研究將熒光納米標(biāo)記物QD通過(guò)BAS與FA結(jié)合，成功制備了一種BAS介導(dǎo)FR靶向QD探針，該探針可顯著提高QD的表面反應(yīng)活性、生物相容性和分散穩(wěn)定性。因FA及生物素均是小分子物質(zhì)，制備過(guò)程直接偶聯(lián)形成的復(fù)合物用于靶向卵巢癌SKOV3細(xì)胞，加入QD-SA后存在較大的空間位阻，結(jié)合至細(xì)胞表面的QD數(shù)量相對(duì)偏少，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)較弱，難以實(shí)現(xiàn)高靈敏性的細(xì)胞檢測(cè)。而B(niǎo)SA是牛血漿中含量最豐富的載體蛋白，表面富含活性氨基，能通過(guò)氨基與羧基反應(yīng)同時(shí)與多個(gè)分子結(jié)合［13］。故使用BSA作為連接載體，將FA和生物素偶聯(lián)。本研究通過(guò)BAS介導(dǎo)FR靶向QD探針，及QD-SA對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞及肺癌A549細(xì)胞的識(shí)別實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了該探針可特異性靶向卵巢癌SKOV3細(xì)胞，同時(shí)證明了隨著FA與細(xì)胞反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)A與細(xì)胞表面FR結(jié)合數(shù)量有所增加，使結(jié)合至細(xì)胞表面的QD數(shù)量增多，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)增強(qiáng)。通過(guò)與QD-FA對(duì)比識(shí)別卵巢癌SKOV3細(xì)胞，表明了BAS可明顯增加細(xì)胞表面FR的結(jié)合數(shù)量，從而顯著放大細(xì)胞表面QD的熒光信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度，縮短檢測(cè)時(shí)間，為成功用于卵巢癌的早期診斷帶來(lái)契機(jī)。

綜上所述，BAS介導(dǎo)FR靶向QD體系可敏感、特異、快速地對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別，為卵巢癌早期診斷提供了新思路。此外，BAS介導(dǎo)FR靶向QD體系還可用于多種FR表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞的識(shí)別，在生物醫(yī)學(xué)研究中有較大的應(yīng)用潛力。

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（2014-05-20收稿）

（2014-08-05修回）

Biotin-streptavidin system-mediated folate receptor-targeted quantum dotin vitroimaging of ovarian cancer SKOV3 cells

Liju NIE1,2,Hengyi XU2,Chenlian YE1,Xiaolin HUANG2,Wenting LIU1,Fen FU1

Fen FU;E-mail:fu_fen@163.com
1Department of Gynecologic Oncology,the Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006;2State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China.
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81372518).

Objective:To develop a biotin-streptavidin system(BAS)-mediated folate receptor(FR)-targeted quantum dot(QD) fluorescent probe and preliminarily validate the targeting ability and signal amplification effect of the probe.Methods:Streptavidin (SA)was covalently coupled with QD through the active ester method;the physical characteristics of the prepared QD-SA were verified.Biotinylated folate was synthesized through the carrier bovine serum albumin using the same method and then reacted with QD-SA to form the special probe.The probe was used to identify SKOV3 cells and FR-negative A549 cells to verify its targeting specificity.QD-SA was used as the contrast.SKOV3 cells were imaged using the BAS-mediated FR-targeted QD probe with a biotinylated folate incubation time of 1 or 4 h.Various reaction times were also tested between the probe and the QD-FA that was formed without BAS mediation.Results:The BAS-mediated FR-targeted QD probe specifically recognized FR-positive SKOV3 cells.The probe obtained higher fluorescent intensity after 4 h than after 1 h of biotinylated folate incubation.The BAS-mediated FR-targeted QD probe also had a stronger fluorescent signal than the QD-FA probe.Conclusion:The proposed probe presents a great potential in the early diagnosis of ovarian cancer because of its high specificity and sensitivity.

biotin-streptavidin,folic acid,quantum dots,ovarian cancer cell,imagingin vitro

10.3969/j.issn.1000-8179.20140842

①江西省南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（南昌市330006）；②江西省南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

*本文課題受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81372518）資助

傅芬 fu_fen@163.com

聶麗菊 專(zhuān)業(yè)方向?yàn)閶D產(chǎn)科學(xué)臨床與基礎(chǔ)研究、循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離與檢測(cè)。

E-mail：704371590@qq.com