PTPMeg2抑制NIH3T3／STAT3CA細(xì)胞模型STAT3轉(zhuǎn)錄活性的研究

蘇富琴，王玉春，齊占鵬，孫 超，侯金才

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院1.藥理學(xué)教研室、2.腫瘤分子生物學(xué)研究室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

腫瘤細(xì)胞在受到細(xì)胞外刺激時(shí)常常通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路傳遞到細(xì)胞內(nèi)。目前，已經(jīng)有多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路得到了深入的研究，如STAT［1］、TGF-β［2］、Wnt［3］信號(hào)通路等，這些細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤中起到重要的作用，也常常被用來作為藥物的靶點(diǎn)、診斷或判定預(yù)后的生物標(biāo)志物。STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族的一員。STAT3對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、增殖和分化等生理過程都至關(guān)重要［4］。如果STAT3基因處于持續(xù)激活狀態(tài)，就能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖，從而引發(fā)多種腫瘤，如前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤和胰腺癌等都可以檢測(cè)到持續(xù)激活的STAT3存在［5-6］。因此，研究STAT3信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控對(duì)腫瘤的治療具有重要的參考價(jià)值。

STAT3的異?；罨袃煞N形式，高磷酸化水平的STAT3和持續(xù)活化的STAT3。蛋白的表達(dá)水平一方面受到蛋白激酶的激活而活化，另一方面受到磷酸酶的調(diào)節(jié)而抑制活化。PTPMeg2（protein tyrosine phosphotase Meg2，又稱PTPN9）是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞質(zhì)酪氨酸磷酸酶。PTPMeg2對(duì)磷酸化STAT3的作用有信號(hào)通路起抑制作用兩種方式，既可以直接對(duì)STAT3去磷酸化［7］，還可以通過對(duì)EGFR、Her2去磷酸化間接抑制 STAT3活性［8］。我們發(fā)現(xiàn)PTPMeg2也可以抑制胰腺癌細(xì)胞STAT3的轉(zhuǎn)錄活性。本研究通過在無成瘤性的成纖維細(xì)胞NIH3T3上建立的持續(xù)活化的STAT3細(xì)胞模型NIH3T3／STAT3CA，觀察PTPMeg2對(duì)此模型細(xì)胞體內(nèi)及體外增殖作用的影響，并通過檢測(cè)STAT3轉(zhuǎn)錄活性的變化而探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑 pXJ40／Flag-STAT3及pXJ40／Flag-STAT3CA質(zhì)粒由曹新民博士（新加坡國(guó)立大學(xué)）惠贈(zèng)；pGL3-luc、pGL3／（APRE）4-luc熒光酶報(bào)告質(zhì)粒由Dr.Sachiko Ezoe博士（日本大阪醫(yī)學(xué)院）惠贈(zèng)；pcDNA3／myc-PTPMeg2及 pcDNA3／PTPMeg2C515S質(zhì)粒由趙志壯教授（美國(guó)Oklahoma健康科學(xué)中心）惠贈(zèng)。Ad／PTPMeg2質(zhì)粒和 shPTPMeg2質(zhì)粒由常智杰教授（清華大學(xué)）惠贈(zèng)。轉(zhuǎn)染試劑vigofect購自威格拉斯試劑公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及NIH3T3／STAT3CA細(xì)胞模型的建立 成纖維細(xì)胞NIH3T3于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清及1×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基。

將具有新霉素抗性的質(zhì)粒 pXJ40 vector和pXJ40／Flag-STAT3CA采用 vigofect轉(zhuǎn)染至 NIH3T3細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收取部分細(xì)胞通過Flag標(biāo)簽檢測(cè)的STAT3CA表達(dá)清況。將1／10細(xì)胞重新種植于100 mm的培養(yǎng)皿中，加入8×105g·L-1新霉素

（G418）進(jìn)行生長(zhǎng)篩選。間隔1 d更換新霉素，直到細(xì)胞增殖得到單克隆，挑取單克隆種植于24孔板中，每孔種植1個(gè)克隆。采用維持劑量的新霉素，通過Western blot檢測(cè)STAT3CA表達(dá)挑選出陽性克隆，即為NIH3T3／STAT3CA細(xì)胞模型，只轉(zhuǎn)染空載體而建立的穩(wěn)定細(xì)胞系為對(duì)照（NIH3T3／vector）。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前2.5 h更換新鮮完全培養(yǎng)基。按照vigofect轉(zhuǎn)染說明書，在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中將需要轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA與100μl 0.9%NaCl混和，在另一轉(zhuǎn)染管中將vigofect與等體積的0.9%NaCl混和，室溫放置5 min。然后將含有vigofect的混合液滴加到質(zhì)粒DNA的混合液中，混勻后再放置15 min后滴入細(xì)胞培養(yǎng)基中，搖勻培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后3 h更換新鮮的完全培養(yǎng)基。

1.4 MTT法對(duì)細(xì)胞增殖能力的測(cè)定 將穩(wěn)定細(xì)胞系 NIH3T3／STAT3CA和對(duì)照細(xì)胞 NIH3T3／vector，按照800個(gè)／孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)處理?xiàng)l件設(shè)10個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞分別感染Ad／PTPMeg2及腺病毒空載體。每間隔24 h取一個(gè)96孔板測(cè)定細(xì)胞的增殖狀態(tài)。測(cè)定時(shí)，棄去培養(yǎng)基，每孔加無血清培養(yǎng)基配制的 MTT 100μl（0.05 g·L-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去全部培養(yǎng)基，每孔加入180μl DMSO溶解甲臜顆粒。10 min之內(nèi)測(cè)板，以570 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，以630 nm為參考波長(zhǎng)，測(cè)定的吸光度值代表細(xì)胞的增殖活力，并計(jì)算平均值。

1.5 裸鼠異體移植瘤實(shí)驗(yàn) 穩(wěn)定細(xì)胞系NIH3T3／STAT3CA，感染腺病毒為載體的 PTPMeg2（Ad／PTPMeg2）和腺病毒空載體（Ad／GFP），感染量采用預(yù)實(shí)驗(yàn)探索的等量病毒量。24h后收獲細(xì)胞，PBS洗滌，BalB／c-nu／nu♂裸鼠6只，每只裸鼠按照100μl細(xì)胞懸液的容量接種到腋下皮下，左側(cè)腋下接種Ad／GFP感染的 NIH3T3／STAT3CA，右側(cè)腋下接種Ad／PTPMeg2感染的 NIH3T3／STAT3CA。接種細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)每側(cè)。每隔3 d用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確量取腫瘤的直徑，短徑記作a mm，長(zhǎng)徑記作b mm。腫瘤體積／mm3＝a×b2／2。裸鼠麻醉，剝離皮下腫瘤，稱重，拍照記錄。瘤重繪制柱狀圖，瘤體積繪制折線圖。數(shù)據(jù)通過SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行成對(duì)t檢驗(yàn)。

1.6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（Co-IP）及 Western blot HEK293T細(xì)胞分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染 pcDNA3／Myc-PTPMeg2、pXJ40／Flag-STAT3CA，共同轉(zhuǎn)染 pcDNA3／Myc-PTPMeg2分 別 與 pXJ40／Flag-STAT3CA 及pXJ40／Flag-STAT3。收獲轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液 （80 mmol· L-1KCl，10 mmol· L-1Na2HPO4，1 mmol·L-1EDTA（pH＝8.0），0.5%NP-40，10%Glycerol.1 mmol·L-1DTT，1 mmol·L-1PMSF，1 mg·L-1Aprotinin，2 mg·L-1Leupeptin，2 mg·L-1Pepstatin，0.1 mmol·L-1Na3VO4）裂解細(xì)胞。冰上放置30 min，4℃12 000 r·min-1×15 min離心。取細(xì)胞裂解物加等容的2×SDSPAGE上樣液煮10 min，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｆ溆嗟募?xì)胞裂解物，加入2μg Flag抗體，4℃混合4 h。然后在上述混合物中加入30μl G蛋白偶聯(lián)的葡聚糖顆粒懸浮液，4℃旋轉(zhuǎn)混合過夜。洗滌葡聚糖顆粒4次，在沉淀中加入30μl 2×SDS-PAGE上樣液煮10 min。Western blot雜交分析蛋白表達(dá)。使用10%的SDS-PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用Western blot檢測(cè)相應(yīng)的結(jié)合蛋白。

1.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 24孔板細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。DNA轉(zhuǎn)染總量為300 ng／孔，其中熒光酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3／（APRE）4的轉(zhuǎn)染量為 100 ng；內(nèi)參質(zhì)粒pRLTK的轉(zhuǎn)染量為5 ng；PTPMeg2WT質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染量為50 ng，PTPMeg2C515S質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染量為200 ng，空載體組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒。最后用空載體質(zhì)粒補(bǔ)足以使每孔轉(zhuǎn)染的DNA總量相同。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染24 h后用PBS洗滌，裂解液充分裂解細(xì)胞。依次加入30μl熒光素酶催化底物I和20μl細(xì)胞裂解物，Top count測(cè)定螢火蟲熒光素酶活性值。再在相同孔中加入30μl內(nèi)參催化底物Ⅱ，再次測(cè)定海腎熒光素酶的活性值。以海腎熒光素酶的活性值為內(nèi)參，計(jì)算報(bào)告基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性，也就是螢火蟲熒光素酶活性值與海腎熒光素酶活性值的比值。用±s記錄結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料采用One-way ANOVA方法進(jìn)行組間方差分析，成對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果采用雙測(cè)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 PTPMeg2抑制 NIH3T3／STAT3CA細(xì)胞的體外增殖 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NIH3T3／STAT3CA細(xì)胞的增殖速度比NIH3T3／vector細(xì)胞明顯加快（P＜0.01，F(xiàn)ig 1），這與活化的STAT3促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)果相一致。在PTPMeg2存在時(shí)，NIH3T3／STAT3CA細(xì)胞的增殖速度明顯減慢（P＜0.01），說明 PTPMeg2對(duì)STAT3CA的細(xì)胞促增殖具有負(fù)性調(diào)控作用。

2.2 PTPMeg2抑制 NIH3T3／STAT3CA細(xì)胞的體內(nèi)增殖 既然PTPMeg2對(duì)NIH3T3／STAT3CA細(xì)胞具有體外的增殖抑制作用，那么體內(nèi)是否也存在這種一致的抑制作用？我們采用了裸鼠異體移植瘤，以腺病毒為載體表達(dá)PTPMeg2，觀察PTPMeg2的作用。結(jié)果NIH3T3／STAT3CA高表達(dá)PTPMeg2后，腫瘤明顯較對(duì)照組?。‵ig 2，A和 B），腫瘤重量（1.643±0.404）g較對(duì)照組（0.367±0.203）g有明顯的減低（P＜0.01，F(xiàn)ig 2，C）。進(jìn)一步證明了PTPMeg2對(duì)STAT3CA的促增殖具有抑制作用。

2.3 PTPMeg2與STAT3CA存在相互作用 PTPMeg2對(duì)STAT3CA的負(fù)性調(diào)控是否直接作用引起的？為了回答這個(gè)問題，我們采用了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在PTPMeg2與Flag-STAT3CA的復(fù)合物中可見明顯的相互作用條帶（Fig 3，第3列），并且強(qiáng)于與STAT3的相互作用（Fig 3，第4列）。說明PTPMeg2與STAT3CA存在相互作用，這種相互作用是其功能的基礎(chǔ)。

2.4 PTPMeg2對(duì)STAT3的轉(zhuǎn)錄活性具有抑制作用 為了進(jìn)一步探索PTPMeg2對(duì)STAT3CA的負(fù)性調(diào)控機(jī)制，STAT3信號(hào)通路最終是在細(xì)胞核內(nèi)激活了相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄基因，而引起相應(yīng)的功能效應(yīng)。我們采用了 STAT3的報(bào)告基因質(zhì)粒 pGL3／（APRE）4，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，PTPMeg2對(duì)STAT3CA的STAT3的轉(zhuǎn)錄活性有明顯的抑制作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（結(jié)果未顯示），而PTPMeg2的功能缺失突變體PTPMeg2C515S則失去了轉(zhuǎn)錄抑制作用（Fig 4，上圖）。我們又進(jìn)一步采用了PTPMeg2的發(fā)夾干擾 RNA，從另一個(gè)方面也證明了 PTPMeg2對(duì)STAT3CA的STAT3的轉(zhuǎn)錄活性有明顯的抑制作用（Fig 4，下圖）。

Fig 1 PTPMeg2 inhibits NIH3T3／STAT3CA cell proliferation in vitro**P＜0.01，STAT3CA／GFP group vs Vector／GFP group；#P＜0.05，##P＜0.01 STAT3CA／PTPMeg2 vs STAT3CA／GFP group.

Fig 2 PTPMeg2 inhibits NIH3T3／STAT3CA cell proliferation in vivoTumor formation was observed（A）in nude mice injected with 2×105 NIH3T3／STAT3CA cells infected with CA／GFP（left）or CA／PTPMeg2（right）.Xenograft tumors（B），tumor volumes（C）and tumor weights（D）are shown.**P＜0.01 vs CA／GFP group

3 討論

經(jīng)典的JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的傳遞過程如下：來自細(xì)胞外的化學(xué)刺激信號(hào)，如干擾素、白介素6（IL-6）、生長(zhǎng)因子與細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合，這就激活了JAK激酶的活性，JAK激酶進(jìn)行自身磷酸化，接下來STAT3蛋白結(jié)合到被磷酸化的受體上，被JAK激酶磷酸化并二聚化，磷酸化的STAT3蛋白從細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)入細(xì)胞核中，結(jié)合到DNA上，啟動(dòng)相應(yīng)STAT3的基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和生存。此外，受體酪氨酸激酶類（EGFR）不通過JAK激酶的磷酸化，可以直接使STAT3的酪氨酸磷酸化。第3種途徑是非受體酪氨酸激酶途徑，即c-Src激酶等可以使STAT3磷酸化。由此可見，STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的核心點(diǎn)就是STAT3的激活。STAT3的持續(xù)激活是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵因素，表現(xiàn)為磷酸化和持續(xù)活化兩種形式。因此，醫(yī)藥工作者采用多種手段去抑制活化的STAT3作為治療腫瘤的策略。

Fig 3 PTPMeg2 interacts with STAT3CA in HEK239T cellsHEK293T cells were transfected Flag-STAT3CA plasmid only in lane 1，Myc-PTPMeg2 plasmid only in lane 2，co-transfected Flag-STAT3CA and Myc-PTPMeg2 plasmid in lane 3，co-transfected Flag-STAT3 and Myc-PTPMeg2 plasmid in lane4.The antibodies precipitated and blotted are shown.

Fig 4 PTPMeg2 inhibits STAT3 transcriptional activity in STAT3CA cell modelUp：PTPMeg2 and its mutant PTPMeg2C515S affected the STAT3 transcriptional activity.Down：PTPMeg2 and ShPTPMeg2 had an effect on STAT3 transcriptional activity.**P＜0.01 vs vector group；#P＜0.05 vs mock group.

抑制活化的STAT3有兩種方式：間接途徑和直接途徑。間接途徑如在信號(hào)通路上游干擾配體與受體的結(jié)合，如應(yīng)用抗IL-6和IL-6受體的單抗阻斷配受體結(jié)合可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)［9］。其次，可以酪氨酸激酶的抑制劑（AG490［10］、Lamatinib［11］）抑制受體和（或）STAT3蛋白上酪氨酸或絲氨酶殘基的磷酸化，可完全阻止STAT3信號(hào)進(jìn)一步下傳。還可以通過酪氨酸磷酸受體-激酶復(fù)合物［包括細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子（SOCS）、活化的STAT3蛋白抑制因子（PIAS）［12］］形成。直接途徑即直接阻斷活化的STAT3的水平和功能治療腫瘤。比如采用小分子物質(zhì)直接抑制STAT3與DNA結(jié)合，合成寡核苷酸誘捕STAT3。直接使用磷酸酶，使磷酸化的STAT3去磷酸化也是一種直接策略。我們以前的工作發(fā)現(xiàn)磷酸酶PTPMeg2可通過去磷酸化STAT3而達(dá)到抗乳腺癌的作用［7］。本研究與前期工作的區(qū)別在于探索了STAT3磷酸化以外的另一種活化形式——持續(xù)活化的 STAT3（STAT3CA），并觀察了PTPMeg2對(duì)STAT3CA細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)錄活性的影響。

藥理學(xué)研究中常常利用疾病的發(fā)病機(jī)制而構(gòu)建疾病模型，用于篩選藥物或者研究藥物的作用機(jī)制。STAT3CA（constitutively activated STAT3）［13］分子的建立最早就是用于證明STAT3是一種原癌蛋白。STAT3CA分子的構(gòu)建是在STAT3 C末端SH2結(jié)構(gòu)域A661和N633的位置上插入了2個(gè)半胱氨酸，這樣半胱氨酸就可以自動(dòng)形成二聚體，而不是依賴Y705的磷酸化位點(diǎn)形成二聚體。二聚體結(jié)合DNA，激活相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄基因。STATCA自身可以介導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，因此可以作為腫瘤STAT3持續(xù)激活的模型。本研究利用腫瘤中存在持續(xù)活化的STAT3，在正常的人成纖維細(xì)胞上構(gòu)建了持續(xù)激活的NIH3T3／STAT3CA細(xì)胞模型，該模型細(xì)胞改變了親本細(xì)胞NIH3T3不能夠成瘤的特性，具有快速增殖能力和在裸鼠體內(nèi)成瘤的能力。Rong等［14］利用該細(xì)胞模型研究了WT1對(duì)STAT3的激活作用，探索了WT1在腎臟腫瘤中的促癌作用。本研究利用該細(xì)胞模型探索磷酸酶PTPMeg2對(duì)持續(xù)激活STAT3的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTPMeg2對(duì)NIH3T3／STAT3CA細(xì)胞的體內(nèi)和體外增殖能力均有抑制作用。PTPMeg2與STAT3CA存在相互作用，并發(fā)現(xiàn)PTPMeg2對(duì)STAT3CA的轉(zhuǎn)錄活性有明顯的抑制作用。通常情況下，PTPMeg2是磷酸酶，對(duì)磷酸化的STAT3起到直接的去磷酸化作用［7］，或者通過抑制磷酸化EGFR而間接降低磷酸化STAT3的水平［8］。而PTPMeg2對(duì)STAT3CA的影響也顯示明顯抑制作用，而實(shí)際上 STAT3CA細(xì)胞中的磷酸化STAT3的水平并不高，PTPMeg2對(duì)STAT3CA抑制的詳細(xì)機(jī)制并不清楚，需要進(jìn)一步探索。

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