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      左卡尼汀調(diào)控鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶表達(dá)抑制過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡作用

      2014-05-19 09:04:17賈桂枝王洪新王翠瑤戴紅良
      中國藥理學(xué)通報 2014年3期
      關(guān)鍵詞:左卡尼汀左卡尼心肌細(xì)胞

      賈桂枝,王洪新,李 紅,王翠瑤,戴紅良

      (遼寧醫(yī)學(xué)院1.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室、2.藥理學(xué)教研室、3.護(hù)理學(xué)院,遼寧錦州 121001)

      心肌缺血/再灌注可引起心肌細(xì)胞廣泛性的壞死,促發(fā)心力衰竭,是目前世界上引起人類死亡的最重要原因之一[1]。缺血/再灌注損傷在人體會引起心肌細(xì)胞產(chǎn)生過多的活性氧,發(fā)生氧化應(yīng)激性的損傷。H2O2等活性氧能改變心肌細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,最終引發(fā)細(xì)胞凋亡[2]。因此,對抗由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡對于臨床治療各種缺血性心臟病意義重大。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,CaN)是目前已知唯一受鈣離子/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的蛋白磷酸酶類。在Ca2+的激活下,對包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)[3-4]。有研究已證實缺血/再灌注損傷[5]、H2O2[6]及血清剝奪[7]等誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡均與CaN有關(guān)。左卡尼汀是位于線粒體膜的機體內(nèi)源性化合物,其主要作用是促進(jìn)長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運至線粒體進(jìn)行β氧化,為機體供能[8]。除此之外,左卡尼汀還具有明顯的抗氧化、抗凋亡活性[9-10]。其可通過緩解細(xì)胞內(nèi)的Ca2+超載,明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[10]。但左卡尼汀抗H2O2致心肌細(xì)胞凋亡的機制是否與CaN有關(guān),仍缺乏相關(guān)報道。為此,本研究利用體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞,探討CaN在左卡尼汀抑制H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中的作用。

      1 材料與方法

      1.1 藥物與試劑 左卡尼汀、環(huán)孢素A(cyclosporin A,CsA)、胰蛋白酶、達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco′s minimum essential medium,DMEM)低糖培養(yǎng)基均購于美國Sigma公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所;AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白定量試劑盒美國Pierce公司;cleaved caspase-3、Bcl-2及Bax一抗購于美國Cell Signaling公司;CaN一抗購自美國Santa Cruz公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗購于美國Sigma公司;辣根過氧化物酶(horseradish peroxide,HRP)標(biāo)記的二抗購于美國Santa Cruz公司。

      1.2 實驗動物 出生1~3 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠,♀♂不拘,由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。動物合格證號:SCXK(遼)2003-0007。

      1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法,參照文獻(xiàn)[10]。取出生1~3 d SD大鼠乳鼠,開胸取出心臟,用 D-Hanks液沖洗3次后剪成約1 mm3大小的碎塊,在37℃條件下,以0.8 g·L-1胰蛋白酶消化分離細(xì)胞。將消化完畢的細(xì)胞以差速貼壁法進(jìn)行純化后,置于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁融合后,換以含0.04%胎牛血清的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞分組用于實驗。

      1.4 實驗分組 在進(jìn)行細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3、Bcl-2及Bax表達(dá)水平分析的實驗中,將體外培養(yǎng)的SD大鼠心肌細(xì)胞隨機分為正常對照組、H2O2處理組、左卡尼?。?.2 mmol·L-1) +H2O2組和 CsA(CaN特異性抑制劑,1μmol·L-1)+H2O2組。在檢測細(xì)胞內(nèi)CaN表達(dá)的實驗中將其分為正常對照組、H2O2處理組、左卡尼?。?.2 mmol·L-1)組和左卡尼?。獺2O2組。H2O2作用強度為200μmol·L-1、12 h刺激。左卡尼汀于加入H2O21 h前加入,CsA于加入 H2O230 min前加入[10-11]。左卡尼汀及 CsA均維持至 H2O2作用結(jié)束。

      1.5 心肌細(xì)胞凋亡測定 將經(jīng)過處理的心肌細(xì)胞用1.25 g·L-1胰蛋白酶消化分離,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×109·L-1后,上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。具體操作方法按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

      1.6 Western blot 待各組細(xì)胞處理結(jié)束后,加細(xì)胞裂解液RIPA[(1%乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P 40,NP-40),0.5% 脫氧膽酸鈉,1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),0.1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)]提取細(xì)胞總蛋白,2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度。取50μg總蛋白,以1×樣品緩沖液配平上樣體積,沸水煮5 min后置10%SDS-PAGE中進(jìn)行電泳,待電泳完成后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。用5%脫脂牛奶封閉1 h,接著加cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、CaN及 GAPDH一抗 4℃孵育過夜。TBS-T充分洗膜后,以HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。TBS-T洗膜后,化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)顯色。利用美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health,NIH)Image J 1.42軟件對掃描的條帶進(jìn)行灰度分析。指定對照組蛋白表達(dá)為1,以其它組與對照組的比值反映各組的相對蛋白表達(dá)。

      1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)值以ˉx±s表示。組間比較采用單因素方差分析。

      2 結(jié)果

      2.1 左卡尼汀及CsA對心肌細(xì)胞凋亡的影響 Fig 1結(jié)果顯示,與對照組相比,H2O2處理組心肌細(xì)胞凋亡明顯增加。而左卡尼汀及CsA預(yù)處理能夠明顯降低H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

      Fig 1 Effect of L-carnitine and CsA on H 2O2-triggered apoptosis in rat cardiac myocytes(n=4)

      2.2 左卡尼汀及CsA對心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Fig 2結(jié)果顯示,與正常組比較,H2O2處理12 h后心肌細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3及Bax的表達(dá)明顯增加,而Bcl-2的表達(dá)卻明顯降低。左卡尼汀及CsA均能明顯地改善H2O2誘導(dǎo)的上述改變。

      2.3 左卡尼汀對心肌細(xì)胞內(nèi)CaN表達(dá)水平的影響Fig 3結(jié)果顯示,與正常組比較,H2O2處理12 h后心肌細(xì)胞內(nèi)CaN表達(dá)水平明顯增加。左卡尼汀能明顯降低H2O2處理組心肌細(xì)胞CaN的表達(dá)。而其本身不影響CaN的表達(dá)。

      3 討論

      本實驗發(fā)現(xiàn),左卡尼汀可通過抑制CaN的過表達(dá)以抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)下心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

      目前越來越多的研究提示缺血/再灌注損傷與心肌細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。盡管缺血/再灌注引起凋亡的確切機制尚未完全闡明,但可以肯定其與氧化應(yīng)激損傷、鈣超載有關(guān)[12-13]。H2O2可誘發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣超載,引起心肌凋亡。而左卡尼汀能夠明顯地緩解鈣超載,抑制其細(xì)胞的凋亡[10]。CaN是細(xì)胞內(nèi)鈣離子執(zhí)行功能的重要靶蛋白之一。最近的研究發(fā)現(xiàn),CaN在H2O2誘導(dǎo)的心肌凋亡中發(fā)揮著重要作用[6]。本實驗也發(fā)現(xiàn),在CaN經(jīng)其特異性抑制劑CsA阻斷后,H2O2所誘發(fā)的各種凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)得到明顯改善。具體表現(xiàn)為促凋亡蛋白cleaved caspase-3及Bax的表達(dá)下調(diào),而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)上調(diào)。心肌細(xì)胞的凋亡也明顯降低。而更為重要的是,左卡尼汀在抑制心肌細(xì)胞凋亡的同時,能夠明顯降低H2O2誘導(dǎo)下CaN的過表達(dá),提示左卡尼汀的抗凋亡活性可能與其抑制CaN的過表達(dá)有關(guān)。

      關(guān)于CaN誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機制,可能涉及以下幾個方面:① 與細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶(ASK1)相互作用[14];② 影響 Bad的磷酸化,拮抗Bcl-2家族抗凋亡作用[15];③去磷酸化(活化)轉(zhuǎn)錄因子活化T細(xì)胞核因子3(nuclear factor of activated T cells 3,NFATc3),使其由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于胞核,介導(dǎo)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[16]。而左卡尼汀抗心肌細(xì)胞凋亡的作用是否也涉及上述機制,仍有待于進(jìn)一步的實驗論證。

      總之,本研究證實左卡尼汀對H2O2誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用,其作用機制可能與調(diào)控CaN的表達(dá)有關(guān)。該發(fā)現(xiàn)為左卡尼汀的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

      Fig 2 Effect of L-carnitine and CsA on apoptosis associated protein expression in rat cardiac myocytes(n=3)

      Fig 3 Effect of L-carnitine on H 2 O2-triggered CaN overexpression in rat cardiac myocytes(n=3)

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