左卡尼汀調(diào)控鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶表達(dá)抑制過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡作用

賈桂枝，王洪新，李 紅，王翠瑤，戴紅良

（遼寧醫(yī)學(xué)院1.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室、2.藥理學(xué)教研室、3.護(hù)理學(xué)院，遼寧錦州 121001）

心肌缺血／再灌注可引起心肌細(xì)胞廣泛性的壞死，促發(fā)心力衰竭，是目前世界上引起人類死亡的最重要原因之一［1］。缺血／再灌注損傷在人體會引起心肌細(xì)胞產(chǎn)生過多的活性氧，發(fā)生氧化應(yīng)激性的損傷。H2O2等活性氧能改變心肌細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡［2］。因此，對抗由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡對于臨床治療各種缺血性心臟病意義重大。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）是目前已知唯一受鈣離子／鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的蛋白磷酸酶類。在Ca2＋的激活下，對包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)［3－4］。有研究已證實缺血／再灌注損傷［5］、H2O2［6］及血清剝奪［7］等誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡均與CaN有關(guān)。左卡尼汀是位于線粒體膜的機體內(nèi)源性化合物，其主要作用是促進(jìn)長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運至線粒體進(jìn)行β氧化，為機體供能［8］。除此之外，左卡尼汀還具有明顯的抗氧化、抗凋亡活性［9－10］。其可通過緩解細(xì)胞內(nèi)的Ca2＋超載，明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［10］。但左卡尼汀抗H2O2致心肌細(xì)胞凋亡的機制是否與CaN有關(guān)，仍缺乏相關(guān)報道。為此，本研究利用體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞，探討CaN在左卡尼汀抑制H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 左卡尼汀、環(huán)孢素A（cyclosporin A，CsA）、胰蛋白酶、達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（Dulbecco′s minimum essential medium，DMEM）低糖培養(yǎng)基均購于美國Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒美國Pierce公司；cleaved caspase-3、Bcl-2及Bax一抗購于美國Cell Signaling公司；CaN一抗購自美國Santa Cruz公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗購于美國Sigma公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxide，HRP）標(biāo)記的二抗購于美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗動物 出生1～3 d的Sprague-Dawley（SD）大鼠乳鼠，♀♂不拘，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。動物合格證號：SCXK（遼）2003-0007。

1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，參照文獻(xiàn)［10］。取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，開胸取出心臟，用 D-Hanks液沖洗3次后剪成約1 mm3大小的碎塊，在37℃條件下，以0.8 g·L－1胰蛋白酶消化分離細(xì)胞。將消化完畢的細(xì)胞以差速貼壁法進(jìn)行純化后，置于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁融合后，換以含0.04%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分組用于實驗。

1.4 實驗分組 在進(jìn)行細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3、Bcl-2及Bax表達(dá)水平分析的實驗中，將體外培養(yǎng)的SD大鼠心肌細(xì)胞隨機分為正常對照組、H2O2處理組、左卡尼?。?.2 mmol·L－1） ＋H2O2組和 CsA（CaN特異性抑制劑，1μmol·L－1）＋H2O2組。在檢測細(xì)胞內(nèi)CaN表達(dá)的實驗中將其分為正常對照組、H2O2處理組、左卡尼?。?.2 mmol·L－1）組和左卡尼?。獺2O2組。H2O2作用強度為200μmol·L－1、12 h刺激。左卡尼汀于加入H2O21 h前加入，CsA于加入 H2O230 min前加入［10－11］。左卡尼汀及 CsA均維持至 H2O2作用結(jié)束。

1.5 心肌細(xì)胞凋亡測定 將經(jīng)過處理的心肌細(xì)胞用1.25 g·L－1胰蛋白酶消化分離，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×109·L－1后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。具體操作方法按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1．6 Western blot 待各組細(xì)胞處理結(jié)束后，加細(xì)胞裂解液RIPA［（1%乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P 40，NP-40），0.5% 脫氧膽酸鈉，1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），0.1%苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）］提取細(xì)胞總蛋白，2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度。取50μg總蛋白，以1×樣品緩沖液配平上樣體積，沸水煮5 min后置10%SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，待電泳完成后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。用5%脫脂牛奶封閉1 h，接著加cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、CaN及 GAPDH一抗 4℃孵育過夜。TBS-T充分洗膜后，以HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。TBS-T洗膜后，化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色。利用美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）Image J 1.42軟件對掃描的條帶進(jìn)行灰度分析。指定對照組蛋白表達(dá)為1，以其它組與對照組的比值反映各組的相對蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)值以ˉx±s表示。組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2．1 左卡尼汀及CsA對心肌細(xì)胞凋亡的影響 Fig 1結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2處理組心肌細(xì)胞凋亡明顯增加。而左卡尼汀及CsA預(yù)處理能夠明顯降低H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

Fig 1 Effect of L-carnitine and CsA on H 2O2-triggered apoptosis in rat cardiac myocytes（n＝4）

2．2 左卡尼汀及CsA對心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Fig 2結(jié)果顯示，與正常組比較，H2O2處理12 h后心肌細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3及Bax的表達(dá)明顯增加，而Bcl-2的表達(dá)卻明顯降低。左卡尼汀及CsA均能明顯地改善H2O2誘導(dǎo)的上述改變。

2．3 左卡尼汀對心肌細(xì)胞內(nèi)CaN表達(dá)水平的影響Fig 3結(jié)果顯示，與正常組比較，H2O2處理12 h后心肌細(xì)胞內(nèi)CaN表達(dá)水平明顯增加。左卡尼汀能明顯降低H2O2處理組心肌細(xì)胞CaN的表達(dá)。而其本身不影響CaN的表達(dá)。

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，左卡尼汀可通過抑制CaN的過表達(dá)以抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)下心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

目前越來越多的研究提示缺血／再灌注損傷與心肌細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。盡管缺血／再灌注引起凋亡的確切機制尚未完全闡明，但可以肯定其與氧化應(yīng)激損傷、鈣超載有關(guān)［12－13］。H2O2可誘發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣超載，引起心肌凋亡。而左卡尼汀能夠明顯地緩解鈣超載，抑制其細(xì)胞的凋亡［10］。CaN是細(xì)胞內(nèi)鈣離子執(zhí)行功能的重要靶蛋白之一。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CaN在H2O2誘導(dǎo)的心肌凋亡中發(fā)揮著重要作用［6］。本實驗也發(fā)現(xiàn)，在CaN經(jīng)其特異性抑制劑CsA阻斷后，H2O2所誘發(fā)的各種凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)得到明顯改善。具體表現(xiàn)為促凋亡蛋白cleaved caspase-3及Bax的表達(dá)下調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)上調(diào)。心肌細(xì)胞的凋亡也明顯降低。而更為重要的是，左卡尼汀在抑制心肌細(xì)胞凋亡的同時，能夠明顯降低H2O2誘導(dǎo)下CaN的過表達(dá)，提示左卡尼汀的抗凋亡活性可能與其抑制CaN的過表達(dá)有關(guān)。

關(guān)于CaN誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機制，可能涉及以下幾個方面：① 與細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶（ASK1）相互作用［14］；② 影響 Bad的磷酸化，拮抗Bcl-2家族抗凋亡作用［15］；③去磷酸化（活化）轉(zhuǎn)錄因子活化T細(xì)胞核因子3（nuclear factor of activated T cells 3，NFATc3），使其由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于胞核，介導(dǎo)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)［16］。而左卡尼汀抗心肌細(xì)胞凋亡的作用是否也涉及上述機制，仍有待于進(jìn)一步的實驗論證。

總之，本研究證實左卡尼汀對H2O2誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，其作用機制可能與調(diào)控CaN的表達(dá)有關(guān)。該發(fā)現(xiàn)為左卡尼汀的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

Fig 2 Effect of L-carnitine and CsA on apoptosis associated protein expression in rat cardiac myocytes（n＝3）

Fig 3 Effect of L-carnitine on H 2 O2-triggered CaN overexpression in rat cardiac myocytes（n＝3）

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