離體大鼠冠狀動脈的分離培養(yǎng)及張力測定技術

鄺素娟，鄧春玉，楊 慧，饒 芳，劉曉穎，張夢珍，朱杰寧，單志新，林秋雄，楊 敏，余細勇

［廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院）醫(yī)學研究中心，廣東省心血管病研究所，廣東廣州 510080］

器官培養(yǎng)是將部分或整體器官在不損傷正常組織結構的條件下進行體外培養(yǎng)的技術。它與整體實驗相比，具有條件恒定、因素單一、便于干預的優(yōu)點。與細胞培養(yǎng)相比，能更客觀地反映細胞與細胞之間的相互聯(lián)系，并避免細胞異質(zhì)性和容易老化等缺點［1］。血管的器官培養(yǎng)因其組織結構和功能系統(tǒng)的完整性，為研究藥物或生理活性物質(zhì)的長效作用提供了有效的方法［2］。目前血管培養(yǎng)應用比較多的是大血管。微細動脈尤其是冠狀動脈，因其血管壁平滑肌數(shù)量少、血管壁薄、管腔小，操作難度大，目前國內(nèi)甚少報道。但不同部位的血管存在異質(zhì)性，為建立微細動脈的培養(yǎng)模型，以便于對微血管的功能進行研究，本文采用大鼠冠狀動脈血管環(huán)進行培養(yǎng)，并利用工具藥檢測了其舒縮功能，發(fā)現(xiàn)本方法簡單可行，可用于進行微血管舒縮功能的研究，現(xiàn)將方法介紹如下。

1 材料

1.1 實驗藥物 5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）、血栓素 A2類似物 （9，11-Dideoxy-11α，9α-epoxymethanoprostaglandin，U46619）、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh），均購于Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基和青鏈霉素雙抗購于Gibco BRL公司；胎牛血清購于Hyclone公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗溶液 Krebs-Henseleit（K-H）溶液（mmol·L－1）：NaCl 119，NaHCO325，MgCl2·6H2O 1，KCl 4.7，KH2PO41.2，CaCl22.5，D-Glucose 11.1。高鉀 K-H溶液（含60 mmol·L－1KCl）：NaCl 63.7，NaHCO325，MgCl2·6H2O 1，KCl 60，KH2PO41.2，CaCl22.5，D-Glucose 11.1。高鉀無鈣液：用EGTA 0.05代替高鉀溶液中的CaCl2，其余成分與高鉀溶液的相同。

1.3 實驗動物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，♂，體質(zhì)量200～250 g，購于中山大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2009-0011。

1.4 實驗儀器 610M型多通道血管張力測定儀（DMT公司，丹麥），PowerLab 8／30生物信號采集處理系統(tǒng)（AD公司，澳大利亞）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海醫(yī)用恒溫設備廠）。StemiDV4型體視顯微鏡（ZEISS公司，德國）。

2 方法

2.1 實驗用品的消毒準備 手術器械、顯微器械及固定心臟的硅膠脂盤用的75%乙醇浸泡消毒30 mim，然后用滅菌的去離子水沖洗數(shù)遍。PBS及其它用品高壓消毒，實驗室環(huán)境用紫外燈照射30 min。

2.2 冠狀動脈血管環(huán)的分離及培養(yǎng) 取SD大鼠，采用頸椎脫臼法處死并將其固定好，先用75%酒精棉球消毒胸腹部皮膚，用大組織鑷、組織剪剪開胸腹部皮膚，換另一組織鑷、組織剪剪開劍突下腹部肌肉及胸廓兩側，向上翻起胸廓充分暴露心臟，眼科鑷和眼科彎剪剪斷胸主動脈等組織，取下心臟，放入4℃預冷的無菌PBS液中，并用PBS液沖洗3次，以洗凈殘余血液及血塊。在冰浴條件下顯微操作分離冠狀動脈，以降低細胞組織的代謝，更好地維持血管的活性。操作時小心去除冠脈外周的心肌組織，避免鉗夾、牽拉血管，以免損傷血管平滑肌，修剪時注意保護血管壁的完整性，不要剪破管壁而影響張力。游離出冠狀動脈，并剪成1.8～2.0 mm的血管環(huán)，置于培養(yǎng)皿中，用DMEM-F12培養(yǎng)基洗1遍，再加入2 ml含10%胎牛血清、1∶100雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)基，在37℃、95%O2和5%CO2的通氣條件下孵育24 h。

2.3 血管環(huán)的固定 將培養(yǎng)好的血管環(huán)穿上兩根直徑40 μm的不銹鋼絲，平行固定于浴槽內(nèi)的兩個鉗夾上，一個鉗夾連接到螺旋測微器，用于調(diào)整脈管的周長，另一個鉗夾連接到一個內(nèi)置的高靈敏度張力傳感器。浴槽內(nèi)預先放置5 ml 37℃預溫的K-H液。調(diào)節(jié)基礎張力至1.5 mN，平衡60 min，期間每隔15 min換液1次，并使張力維持在1.5 mN。在加入不同藥物后，血管張力的變化信號通過張力傳感器，再經(jīng)過數(shù)模轉(zhuǎn)換器輸入計算機，完成記錄。實驗全程浴槽內(nèi)的K-H液持續(xù)通以含95%O2和5%CO2的混合氣，溫度控制在37℃±0.5℃。

2.4 血管功能性檢測［3］首先用含 60 mmol·L－1KCl的高鉀溶液刺激血管，檢測血管張力的反應性。把浴槽內(nèi)的K-H液換成含高鉀的K-H液。高鉀使冠狀動脈環(huán)產(chǎn)生收縮反應，維持5 min待張力穩(wěn)定后，以5 min末的激活張力作為100%（張力單位為mN／mm），充分沖洗（沖洗5次，每次間隔5 min）至基線，間隔30 min后，重復上述實驗。前后兩次高鉀刺激，血管收縮的幅度相差不超過10%的用于下一步實驗。

2.5 各種血管舒縮藥物對培養(yǎng)的冠狀動脈環(huán)的作用 對血管功能性檢測合格的血管，采用累積給藥法，向浴液中分別加入各濃度梯度的血管收縮藥物5-HT、U46619、CaCl2及血管舒張藥物ACh，記錄血管張力的變化。

2.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計學處理 以兩次高鉀誘發(fā)收縮張力的均值作為標準值100%，各收縮劑／高鉀收縮的幅度的百分比來表示；血管舒張劑是以收縮劑誘發(fā)的最大穩(wěn)定收縮幅度定為標準值100%，血管舒張／收縮的幅度以占標準值的百分比來表示，EC50表示產(chǎn)生50%最大效應時的藥物濃度，pD2為產(chǎn)生最大效應的50%時激動劑摩爾濃度的負對數(shù)，pD2＝－lg（EC50）。所有數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示，采用Prism3.0軟件對數(shù)據(jù)進行曲線擬合，繪制收縮及舒張曲線，并根據(jù)E-quation 1求得lgEC50和最大收縮或舒張百分比的變化值（Emax）。

3 實驗結果

3．1 冠狀動脈環(huán)對血管收縮劑5-HT的反應 采用累積給藥法，加入5-HT，使浴槽中藥物濃度分別達到0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10μmol·L－1，記錄血管張力的變化。結果如下圖所示，培養(yǎng)的冠狀動脈環(huán)對5-HT產(chǎn)生明顯的濃度依賴性收縮反應，pD2為（7.02±0.58），Emax為（147.86±0.21）%，（n＝10），見 Fig 1。

Fig 1 Concentration-dependent contractive response of organ cultured coronary arterial rings induced by 5-HT（0.003－10μmol·L－1）

3．2 冠狀動脈環(huán)對血管收縮劑U46619的反應 采用累積給藥法，加入U46619，使浴槽中藥物濃度分別達到0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μmol·L－1，記錄血管張力的變化。結果如Fig 2所示，培養(yǎng)的冠狀動脈環(huán)對U46619產(chǎn)生明顯的濃度依賴性收縮反應，pD2為（6.48±0.28），Emax為（130.31±0.36）%，（n＝5）。

Fig 2 Concentration-dependent contractive response of organ cultured coronary arterial rings induced by U46619（0.01－3μmol·L－1）

Fig 3 Concentration-dependent contractive response of organ cultured coronary arterial rings induced by CaCl2（0.01－5 mmol·L－1）

Fig 4 ACh（0．003－30μmol·L－1）induced concentration-dependent relaxation of organ cultured coronary arterial rings after the 5-HT induced contraction

3．3 冠狀動脈環(huán)對CaCl2的反應 把浴槽中的K-H液換成無鈣高鉀溶液，待血管穩(wěn)定后，采用累積給藥法，加入CaCl2，使浴槽中藥物濃度分別達到 0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、5 mmol·L－1，記錄血管張力的變化。結果如Fig 3所示，培養(yǎng)的冠狀動脈環(huán)對CaCl2產(chǎn)生明顯的濃度依賴性收縮反應。pD2為（3.54±0.19），Emax為（131.56±0.41）%，（n＝7）。

3．4 冠狀動脈環(huán)對血管舒張劑ACh的反應 先用2μmol·L－15-HT預收縮血管環(huán)，待張力穩(wěn)定后加入ACh，使浴槽中藥物濃度達到 0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30 μmol·L－1，記錄血管張力的變化。結果如Fig 4所示，5-HT預收縮的離體培養(yǎng)的冠狀動脈環(huán)對ACh產(chǎn)生舒張反應，與5-HT預收縮的最大張力相比，呈濃度依賴性舒張作用，pD2為（6.99±0.23），Emax為（78.12±0.13）%，（n＝4）。

4 討論

血管器官培養(yǎng)的方法有多種，有簡單孵育法、格柵培養(yǎng)法、瓊脂孔培養(yǎng)法等，其中最簡單易行的是簡單孵育法。此方法與細胞培養(yǎng)相比能更好地體現(xiàn)了血管作為一個整體的結構和功能。

本文采用簡單孵育法，以頸椎脫臼法處死大鼠，分離出冠狀動脈環(huán)進行體外培養(yǎng)。冠狀動脈環(huán)培養(yǎng)24 h后，用兩根不銹鋼絲平行穿過血管腔，固定于張力測定儀的鉗夾上，對血管平滑肌進行張力測定。發(fā)現(xiàn)血管收縮劑5-HT、U46619及CaCl2能使其產(chǎn)生濃度依賴性收縮，血管舒張劑ACh能使其產(chǎn)生濃度依賴性舒張，說明體外培養(yǎng)的離體冠狀動脈平滑肌具有其類似于在體時的舒縮功能，此方法能用于進行血管平滑肌舒縮功能的研究。

目前國內(nèi)對血管的器官培養(yǎng)及張力測定的研究多見于大血管如主動脈，微血管尤其是冠狀動脈因其壁薄腔小，難于從組織完整分離而不損傷平滑肌，穿鋼絲做張力測定時又極易損傷血管內(nèi)皮，因此分離微血管做張力測定的操作難度遠遠大于大血管，筆者認為操作中應注意以下幾點。首先，動物處死方法的選擇。動物處死的方法有多種，應根據(jù)實驗目的、取材部位選擇不影響實驗結果的方法。頸椎脫臼處死法是大、小鼠最常用的處死方法，并且可避免麻醉藥對某些血管平滑肌的功能造成影響，進行血管張力實驗應盡量采用此法。不管采用哪一種方法，都應遵循安樂死的原則，使實驗動物短時間無痛苦地死亡。其次，在血管的分離過程中要在冰浴下進行，盡量降低組織代謝，保持血管良好的活性。游離血管時不要鉗夾、牽拉血管以免損傷平滑肌。外周的脂肪組織要去除干凈，因為血管外膜周圍脂肪細胞可釋放脂肪源性舒張因子，降低離體動脈對收縮物質(zhì)的收縮反應。在穿鋼絲時手要穩(wěn)，盡量在血管腔中間一次穿過，避免鋼絲刺到管壁平滑肌。穿血管的鋼絲應保持筆直，避免折曲而損傷血管內(nèi)皮。張力測定全程通以混合氣，氣流的速度應控制好（以3～5個氣泡／秒為宜），氣泡太大或太快會沖擊血管環(huán)及鋼絲，影響張力的測定，太小則不能為離體血管提供足夠的氧氣?？傊?，操作中保持血管平滑肌的完整性與良好活性是血管張力測定實驗得以進行的前提。本研究成功建立的冠狀動脈環(huán)培養(yǎng)及張力測定技術，為研究各種因素對微血管的功能性影響提供了新的手段。

器官培養(yǎng)與細胞培養(yǎng)相比，具有相對的完整性，能更客觀地反映細胞與細胞之間的相互關系。而單個細胞的體外培養(yǎng)，缺乏細胞間的聯(lián)系及信號的刺激，可致表面受體功能喪失和基因產(chǎn)物停止表達，失去其在器官水平時的形態(tài)甚至功能。例如，血管平滑肌細胞體外培養(yǎng)時，其表型可發(fā)生改變，可由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。血管的器官培養(yǎng)則避免了這些影響，可有效彌補細胞培養(yǎng)的不足，在培養(yǎng)過程中還可于培養(yǎng)基中添加各種藥物和體液因子，因而越來越廣泛應用于血管醫(yī)學的研究，尤其是研究血管平滑肌舒縮功能方面。

有文獻報道［4－5］胎牛血清可減弱收縮劑誘導的體外培養(yǎng)大鼠腸系膜動脈平滑肌收縮與內(nèi)皮依賴性舒張，而無血清的器官培養(yǎng)也可能導致血管出現(xiàn)一些功能的改變，例如收縮功能降低，受體激動劑敏感性增加以及受體表達水平的改變［6－9］。不同器官的血管分布的受體種類和數(shù)量不一，存在著異質(zhì)性。本研究進行器官培養(yǎng)的血管是大鼠冠脈，用無血清、胎牛血清的培養(yǎng)是否能引起類似的結果還不太清楚。下一步實驗擬研究用無血清、胎牛血清和自體血清進行血管器官培養(yǎng)，觀察與急性分離的血管平滑肌舒縮功能的差異。

當然，器官培養(yǎng)屬于體外培養(yǎng)，血管處于一種松弛不受力的狀態(tài)，在此狀態(tài)下血管對某些刺激的反應與生理情況下不同［10－13］，另外還缺乏在體時受到神經(jīng)體液因素及血流對管壁造成的壓力等因素的影響，與在體血管在生理結構和功能上并不完全相同，所以不能將離體培養(yǎng)血管的實驗結果完全等同于在體，要客觀地評價實驗結果對其整體的價值。

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