類葉升麻苷在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布研究

甘 萍，霍仕霞，白 鵬，高 莉，彭曉明，何 燕，閆 明

（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002；2.新疆維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830049）

類葉升麻苷是本室從新疆列當(dāng)屬植物紫花列當(dāng)（Orobanche coerulescens）中分離純化后得到的苯乙醇苷類化合物，具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)記憶力、抗腫瘤、抗氧化等生物學(xué)活性，近年來被廣泛應(yīng)用于治療阿爾采末?。ˋlzheimer′s disease，AD）方面的研究。此前已有文獻(xiàn)證實(shí)，類葉升麻苷能改善神經(jīng)細(xì)胞凋亡［1］，對(duì)帕金森病具有一定的治療作用［2－3］。本課題組致力于類葉升麻苷在治療AD方面的應(yīng)用，前期研究結(jié)果表明：在離體試驗(yàn)中，類葉升麻苷能拮抗岡田酸（Okadaic acid，OA）誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞tau蛋白異常磷酸化［4］；在體條件下，可以對(duì)抗AlCl3、半乳糖復(fù)合模型所致的小鼠AD病理損傷［5］，顯示出一定的開發(fā)價(jià)值。為了進(jìn)一步了解其在體內(nèi)的吸收、分布規(guī)律，有必要對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布特征做系統(tǒng)的研究，為藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 島津LC-20AB高效液相色譜儀，島津LC-solution色譜工作站；MTN-2800W型氮?dú)獯蹈蓛x，天津奧特賽斯有限公司；ALLEGRA 64R型高速低溫離心機(jī)，美國PE公司；JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝科器研究所；G560E型渦旋震蕩混勻儀，美國。

1.2 主要試劑 類葉升麻苷由新疆維吾爾醫(yī)藥研究所基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供，其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振波譜法和質(zhì)譜法確認(rèn)，HPLC面積歸一化法鑒定其純度＞99%；乙腈和甲醇，色譜純，Sigma-Alorich公司提供；對(duì)香豆酸，上海源葉生物科技有限公司（20120415）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年的SD大鼠60只，♀♂對(duì)半，體質(zhì)量220～250 g，購于新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：XJMUSYDW2013000010。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。

1.4 供試品溶液 精密稱取類葉升麻苷適量，用適量生理鹽水溶解，得到供試品溶液。

1.5 色譜條件 色譜柱：VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5μm），Shim-Pack保護(hù)柱；流動(dòng)相：甲醇 －乙腈－0.2%甲酸（15∶10∶75），流速為 1 ml·min－1，檢測(cè)波長330 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μl。

1.6 給藥與組織樣品采集 將60只SD大鼠隨機(jī)分為10組，每組6只，確定給藥劑量為300 mg·kg－1。于灌胃給藥 0.08、0.17、0.33、0.5、0.67、1、1.5、3、6、12 h后，乙醚微麻，腹主動(dòng)脈取血，至動(dòng)物死亡。迅速剖離出心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、全腦、腸、肌肉、脂肪、睪丸／卵巢，取到的樣本必須有一致性和代表性，用生理鹽水沖去其表面血污，濾紙吸干表面殘留液后稱重，于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 樣品處理和分析 各組織樣品按實(shí)際稱取重量，按質(zhì)量體積比1∶2加入生理鹽水，制成組織勻漿液。于4℃、8 000 r·min－1，離心 15 min。取上清液或血漿樣品0.5 ml，按體積比1∶2加入預(yù)冷甲醇，對(duì)香豆酸（內(nèi)標(biāo)）適量，渦旋混勻3 min。于4℃，12 000 r·min－1，離心15 min。取上清液，于37℃恒溫水浴上用氮吹儀吹干樣品。加入色譜甲醇0.2 ml復(fù)溶，用0.22μm濾膜過濾，進(jìn)樣20μl，HPLC測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 專屬性 取大鼠空白組織或血漿，不加內(nèi)標(biāo)溶液，按“1.7”項(xiàng)下方法處理分析，獲得空白樣品色譜圖；將類葉升麻苷標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加到空白樣品內(nèi)，同法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖；同法得到大鼠給藥后的色譜圖。專屬性考察結(jié)果顯示，各樣品中的雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果無干擾。類葉升麻苷和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為11、13 min，峰型良好，分離度符合要求，色譜圖見Fig 1。

Fig 1 Chromatogram of acteoside

2.2 線性范圍 精密量取不同體積的類葉升麻苷對(duì)照品溶液，加到大鼠組織勻漿液或血漿內(nèi)，總體積為200μl（大鼠組織勻漿液或血漿150μl＋對(duì)照品溶液50μl）。每條標(biāo)準(zhǔn)曲線7個(gè)濃度，每個(gè)濃度平行處理樣品6份，按“1.7”項(xiàng)下方法處理分析。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.05～70 mg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r＞0.998，定量限為0.05 mg·L－1。

2.3 精密度和準(zhǔn)確度 按“1.7”項(xiàng)下方法處理制備高、中、低3種濃度的類葉升麻苷樣品，平行操作6份，于同1 d內(nèi)測(cè)定3次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度。各組織或血漿日內(nèi)精密度RSD為 0.88% ～3.12%；日間精密度 RSD為0.92%～4.25%，符合要求。

2.4 回收率 按“1.7”項(xiàng)下方法處理制備高、中、低3種濃度的類葉升麻苷樣品，平行操作6份，以處理后的樣品色譜峰面積與相應(yīng)濃度的未經(jīng)處理的樣品色譜峰面積之比，考察方法的提取回收率。結(jié)果顯示回收率為91.35%～112.02%，RSD值均小于10%，說明該提取方法符合要求。

2.5 穩(wěn)定性 按“1.7”項(xiàng)下方法處理制備高、中、低3種濃度的類葉升麻苷樣品，平行操作6份，分別考察在37℃放置2 h、室溫放置24 h、4℃放置72 h條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示RSD值均小于4.01%，樣品在上述條件下均基本穩(wěn)定。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 大鼠灌胃給予類葉升麻苷后，各時(shí)間點(diǎn)所測(cè)得的血藥濃度數(shù)據(jù)見Fig 2。用DAS 2.0軟件擬合，類葉升麻苷血藥動(dòng)力學(xué)符合二室開放模型，此時(shí)的AIC數(shù)值最小，相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見Tab 1。

Fig 2 Plasma concentration of acteoside after intragastric administration of 300 mg·kg－1 acteoside to rats（n＝6）

Tab 1 Pharmacokinetic parameters of acteoside after intragastric administration

Fig 3 Concentration of acteoside in tissues after intragastric administration of 300 mg·kg－1 acteoside to rats（n＝6）

2.7 類葉升麻苷在大鼠體內(nèi)組織分布 實(shí)驗(yàn)測(cè)得類葉升麻苷組織器官分布數(shù)據(jù)見Fig 3。結(jié)果顯示，給藥后類葉升麻苷濃度變化出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，各組織藥物濃度除肝臟、腎臟外，其余均大于血漿內(nèi)藥物濃度。組織內(nèi)類葉升麻苷分布結(jié)果：腸＞脾臟＞肺＞肌肉＞卵巢、睪丸＞體脂＞心臟＞全腦＞腎臟＞肝臟。

3 討論

AD是嚴(yán)重威脅老年人健康的一種常見病，85歲以上人群發(fā)病率高達(dá)50%［6］。本課題組在確定了類葉升麻苷對(duì)AD具有一定治療效果后，對(duì)其在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)中，類葉升麻苷含量測(cè)定的方法參照2010版中國藥典相應(yīng)方法，在此基礎(chǔ)上延用本課題組先前色譜條件進(jìn)行測(cè)定［7］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法簡便、經(jīng)濟(jì)，符合生物樣品測(cè)定要求。此外，按照新藥指導(dǎo)原則要求并結(jié)合預(yù)試結(jié)果，對(duì)吸收相、分布相及消除相取樣點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，最終確定實(shí)驗(yàn)時(shí)長為12 h、選取10個(gè)采樣點(diǎn)，給藥濃度為300 mg·kg－1。結(jié)果顯示，給藥12 h內(nèi)，所取的各組織內(nèi)均測(cè)得類葉升麻苷藥物含量，且12 h后各組分內(nèi)藥物濃度均小于峰值的10%，能夠反映出藥物在大鼠體內(nèi)的分布特點(diǎn)。

在新藥研發(fā)過程中，藥物在吸收、分布、代謝和消除過程中具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和較低的毒副作用是候選藥物通過臨床試驗(yàn)的關(guān)鍵所在。由于吸收率、穩(wěn)定性、毒副作用，淘汰的藥物占到新藥開發(fā)的50%［8］。因此，本實(shí)驗(yàn)藥動(dòng)學(xué)結(jié)果表明：經(jīng)灌胃給藥后，類葉升麻苷在體內(nèi)的吸收過程符合二室開放模型，其吸收和消除都快，沒有明顯的體內(nèi)蓄積現(xiàn)象。其分布半衰期和消除半衰期均較小，體內(nèi)藥物濃度很快達(dá)到峰值，又很快消除，提示藥物在體內(nèi)產(chǎn)生臟器毒性的可能較小。同時(shí)，類葉升麻苷在體內(nèi)的濃度－時(shí)間曲線出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，且兩次達(dá)峰相隔時(shí)間較短，這可能與藥物初次吸收后同體內(nèi)脂肪結(jié)合，從而出現(xiàn)短暫的蓄積現(xiàn)象后又釋放入血有關(guān)。

組織分布結(jié)果顯示，類葉升麻苷灌胃給藥后，能很快被吸收入血并在各組織中分布，其中腸、脾臟、肺臟、肌肉中分布較高，這可能與藥物經(jīng)腸道吸收、臟器血管分布疏密有關(guān)；在全腦和睪丸中均檢測(cè)出一定濃度的類葉升麻苷游離藥物存在，表明藥物自身便可透過血腦屏障、血睪屏障進(jìn)入相應(yīng)組織內(nèi)，且相對(duì)含量均高于血漿內(nèi)藥物濃度。實(shí)驗(yàn)中，血漿及個(gè)別組織中測(cè)得類葉升麻苷的含量較低，這可能由于藥物與血漿蛋白結(jié)合率較高，游離的藥物濃度減少及藥物經(jīng)血管外給藥所帶來的首過消除效應(yīng)所致。

鑒于AD的發(fā)病部位集中在大腦，臨床病理研究也大多專注在腦部的病理改變，類葉升麻苷能透過血腦屏障的這一特性提示出其潛在的藥物開發(fā)前景。同時(shí)，可結(jié)合相關(guān)緩釋、靶向技術(shù)［9－10］，將提高藥物腦靶向藥效、延長藥物作用時(shí)間、降低藥物臟器毒性、減少藥物對(duì)生殖系統(tǒng)的不良影響作為后續(xù)研究目標(biāo)。

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