基于UPLC-Q-TOF／MS研究參附注射液的物質(zhì)基礎(chǔ)

何家樂，周思思，馬增春，梁乾德，王宇光，譚洪玲，肖成榮，湯響林，高 月

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，安徽合肥 230032；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

方劑是臨床主要的用藥形式，傳統(tǒng)的中藥復(fù)方都是中藥材按照一定的組方原理構(gòu)成，近年來有效成分的配伍正在成為復(fù)方藥物研究開發(fā)的一種新的趨勢，通過配伍優(yōu)化從而明顯提升復(fù)方中藥的科技含量［1］。

參附注射液是由紅參和附片的提取物制成的復(fù)方制劑，本室前期考察了參附配伍后對雙酯型二萜生物堿、藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白的影響［2－4］。為進(jìn)一步考察組分配伍對體內(nèi)過程的影響，我們運用超高效液相色譜／四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（ultra performance liquid chromatography／quadrupole time-offlight mass spectrometer，UPLC／Q-TOF-MS）技術(shù)對參附注射液的成分以及入血成分進(jìn)行定性定量分析，為參附成分間相互作用研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Wistar大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供［動物合格證號：SCXK－（軍）2007-004］。

1.1.2 試劑與材料 甲醇（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、甲酸（色譜純，CNW Technologies GmbH公司）、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司）、參附注射液（雅安三九藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號121220010）、人參皂苷Rd、Ro、Rc（上海源葉生物科技有限公司，批號 20120505、20120805、20120427）、人參皂苷 Rg1、Rb1、Rb2（中國藥品生物制品檢定所，批號110703-201027、110704-201122、111715-200802）。

1.1.3 儀器 Acquity UPLC系統(tǒng)和Synapt MS四級桿飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)（Waters公司）、Acquity HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm I.D.，1.8μm，Waters公司）、MassLynx V4.1質(zhì)譜工作站（Waters公司）、純水儀（Millipore Simplicity）、氮氣吹干儀（余姚市長江溫度儀表廠，TTL-DCⅡ型）、冷凍離心機（Heraeus Labofuge 400R）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱Acquity HSS T3（100 mm ×2.1 mm I.D.，1.8μm，Waters公司），柱溫45℃，進(jìn)樣量 5μl，流速0.45 ml·min－1；流動相 A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫條件（0→1 min：2%B；1→2 min：2%→5%B；2→3 min：5% → 20%B；3→6 min：20%→30%B；6→10 min：30%→33%B；10→13 min：33%→36%B；13→17 min：36%→40%B；17→18 min：40% → 100%B；18→19 min：100%→2%B；19→20 min：2%B）［5］。

1.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離離子源（ESI），正離子V模式檢測：m／z范圍70－1000，錐孔電壓40 V，毛細(xì)管電壓2.9 V，脫溶劑溫450℃，離子源溫度100℃，錐孔氣流量50 L·h－1，脫溶劑氣體流速900 L·h－1，質(zhì)量校正質(zhì)核比 m／z 556.2771；負(fù)離子V模式檢測：m／z范圍 70－1200，錐孔電壓為 40 kV，毛細(xì)管電壓3 V，脫溶劑溫為450℃，離子源溫度為100℃，錐孔氣流量50 L·h－1，脫溶劑氣體流速為 900 L· h－1，質(zhì) 量 校 正 質(zhì) 核 比 為 m／z 554.2615［6］。

1.2.3 血清樣品的制備 8只Wistar大鼠常規(guī)飼養(yǎng)數(shù)天適應(yīng)環(huán)境后，隨機編號，給藥前禁食12 h，不禁水，按照臨床劑量尾靜脈注射給予參附注射液2 ml，于給藥前，以及給藥后 5、15、30、45、60、90、120 min，3、4、6、8、12、24、48 h眶后靜脈采血 500μl，離心后分別取200μl的血清，加入800μl的甲醇，再加入100μl苦杏仁苷作為內(nèi)標(biāo)充分渦旋混合，13 000 r·min－1離心 10 min，取上清，吹干，200μl流動相（乙腈 ∶水＝1∶1）復(fù)溶，高速離心，取上清，即為樣品，4℃保存，待測。

1.2.4 人參皂苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 制備材料中所述6種人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過預(yù)實驗確定人參皂苷 Rd的濃度分別為 8、10、20、40、60、80μmol·L－1；人參皂苷 Rg1的濃度分別為 4、8、16、24、32、40 μmol·L－1；人參皂苷 Rb1的濃度分別為 10、20、20、40、80、120μmol·L－1；人參皂苷 Ro的濃度分別為4、10、16、24、40、60μmol·L－1；人參皂苷 Rc的濃度分別為8、10、20、40、60、100μmol·L－1；人參皂苷 Rb2的濃度分別為8、10、20、40、60、100μmol·L－1。

1.2.5 方法學(xué)考察 取空白血清180μl，加6種人參皂苷混合對照品溶液，配制成系列血清樣品，按上述樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析，以測得的峰面積Y對血藥濃度X作線性回歸。同法配置低、中、高3個濃度（即加入的人參皂苷Rd的濃度分別為10、40、80μmol·L－1；人參皂苷 Rg1的濃度分別為 8、24、40μmol·L－1；人參皂苷 Rb1的濃度分別為 20、40、120μmol·L－1；人參皂苷 Ro的濃度分別為 10、24、60μmol·L－1；人參皂苷 Rc的濃度分別為 10、40、100μmol·L－1；人參皂苷Rb2的濃度分別為10、40、100μmol·L－1）的樣品，按上述樣品處理方法處理操作，隨標(biāo)準(zhǔn)曲線同時測定，計算方法回收率、日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察 在所選的實驗條件下，血清中的內(nèi)源物質(zhì)并不干擾人參皂苷的測定。Rd、Rg1、Rb1、Ro、Rc、Rb2等6種人參皂苷的最低檢測限分別為0.10、0.17、0.11、0.09、0.11、0.11μg·L－1，定量下限分別是 0.54、0.30、0.99、0.51、0.96、2.02μg·L－1。該方法6種人參皂苷分別在7.93～79.3、3.38～33.8、11.1～132.8、3.82～57.33、8.62～107.76、8.62～107.76μg·L－1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為＾Y＝0.0187X＋0.0693（r2＝0.9934）、＾Y＝0.0399X＋0.0052（r2＝0.9984）、＾Y＝0.0294X－0.2007（r2＝0.9870）、＾Y＝0.0428X＋0.0568（r2＝0.9954）、＾Y＝0.0225X－0.0643（r2＝0.9962）、＾Y＝0.0112X＋0.0209（r2＝0.9977）。6種人參皂苷 Rd、Rg1、Rb1、Ro、Rc、Rb2在低中高3個濃度的日內(nèi)精密度、日間精密度、準(zhǔn)確度RSD均小于10%?；厥章试?6.8%～96.2%之間，RSD≤9.1%，符合SFDA的相關(guān)要求。由此可見，本實驗建立的LC-MS方法適用于血清中6種人參皂苷濃度的測定。

2.2 體外實驗 利用LC-MS對參附注射液中的化合物進(jìn)行了定性鑒別，得到參附注射液正負(fù)離子模式下的總離子流圖（Fig 1、2）。采用 MassLynx4.1對正負(fù)離子模式總離子流圖進(jìn)行處理，并進(jìn)行峰標(biāo)記。在電噴霧一級譜中獲得標(biāo)記峰的分子量信息，結(jié)合Mass值、保留時間和EMS軟件數(shù)據(jù)庫對主要分子峰進(jìn)行歸屬，確定峰化合物信息，如Tab 1、2所示，質(zhì)量精確度誤差均小于5ppm。

Fig 1 Total ion chromatogram of Shenfu injection in negative ion mode

2.3 體內(nèi)實驗 8只180～220 g健康Wistar大鼠飼養(yǎng)72 h適應(yīng)環(huán)境后，尾靜脈注射參附注射液2 ml，測得的人參皂苷平均血藥濃度－時間曲線見Fig 3。主要的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)見Tab 3。

3 討論

方劑作用的物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機制、配伍規(guī)律及體內(nèi)過程是中藥研究的核心科學(xué)問題。附子的主要成分為烏頭類生物堿，分為雙酯型二萜類生物堿和單酯型二萜類生物堿，附子的化學(xué)成分含有多種既是有效成分又是有毒成分的成分，其中雙酯型二萜類如烏頭堿（aconitine）、中烏頭堿（mesaconitine）、次烏頭堿（hypaconitine）既表現(xiàn)出抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用，也表現(xiàn)出引發(fā)心率失常的毒理作用［7］。如何把握附子的“減毒存效”與“增效減毒”的問題，成為當(dāng)前需要重點研究的內(nèi)容之一［8］。

Fig 2 Total ion chromatogram of Shenfu injection in positive ion mode

Tab 1 Ginsenosides detected in Shenfu injection

Fig 3 Mean serum concentration-time curves of ginsenosides after intravenous injection of 2 ml Shenfu in rats（n＝8）

Tab 2 Alkaloids detected in Shenfu injection

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of ginsenosides after intravenous injection of 2 ml Shenfu in rats（ˉx±s，n＝8）

對參附注射液的入血成分研究結(jié)果表明，血清中能夠定量檢測到的6種人參皂苷，人參皂苷Rg1、Ro的血藥維持時間較短，人參皂苷 Rd、Rb1、Rb2、Rc的血藥維持時間較長。觀察其結(jié)構(gòu)可發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd屬于達(dá)瑪烷型三萜皂苷原人參二醇型化合物，人參皂苷Rg1屬于達(dá)瑪烷型三萜皂苷原人參三醇型化合物，而Ro則屬于齊墩果酸型皂苷，這種結(jié)構(gòu)上的差異可能是造成血藥維持時間差別的原因。目前對人參皂苷類成分的藥代研究文獻(xiàn)較多［9－10］，但同時檢測多個人參皂苷類成分的文獻(xiàn)較少。參附注射液的入血成分中未發(fā)現(xiàn)生物堿類成分，這與參附注射液中生物堿的含量較低有關(guān)，而文獻(xiàn)曾報道參附注射粉的入血成分中含有生物堿類成分［11］。

方劑組分配伍作用可發(fā)生在化學(xué)、藥代、藥效等多個層次，其作用模式可在藥代－藥效環(huán)節(jié)產(chǎn)生協(xié)同、拮抗等相互作用［12］。本文在藥代層次上對參附注射液體外、體內(nèi)成分的分析為組分配伍研究建立了可靠的方法。

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