碘化N-正丁基氟哌啶醇抑制大鼠過(guò)氧化氫作用心肌細(xì)胞L型鈣通道電流的增大

黃勇攀，高分飛，石剛剛

（1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng) 550004；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東汕頭 515041）

鈣超載是缺血／再灌注損傷（I／R）重要機(jī)制之一。心肌I／R引起鈣通道開(kāi)放，大量的鈣離子通過(guò)鈣通道進(jìn)入心肌細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載。碘化N-正丁基氟哌啶醇（F2）是我們課題組合成的具有拮抗心肌I／R損傷作用，結(jié)構(gòu)全新的氟哌啶醇季銨鹽衍生物，研究發(fā)現(xiàn)F2能阻斷正常心肌細(xì)胞鈣通道及抑制缺氧條件下鈉鈣交換體電流防止鈣超載，減輕大鼠和家兔心肌 I／R損傷［1－3］。但是 F2對(duì)過(guò)氧化氫作用ICa，L的作用還不清楚。本研究通過(guò)建立過(guò)氧化氫作用模型來(lái)模擬心臟I／R氧自由基損傷ICa，L變化并探討F2對(duì)I／R ICa，L作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 成年♂ SD大鼠，體質(zhì)量180～250 g，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：2004A062。

1.2 藥物和儀器 F2，由本研究室合成（分子質(zhì)量559.61，純度98.6%），結(jié)構(gòu)由中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)所鑒定，保存在 DMSO，濃度為0.1 mol·L－1；nifedipine、CsCl、HEPES和 BAPTA均購(gòu)自 Sigma Chemical Co，St.Louis，MO；膜片鉗系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Axon公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司。

1.3 單個(gè)大鼠心室肌細(xì)胞的分離制備 SD大鼠斷頭，頸動(dòng)脈放血，迅速取下心臟，在4℃無(wú)鈣液（mmol·L－1：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl21.0，NaH2PO40.33，glucose 10，HEPES1.0，pH 7.4）中去除脂肪及心包膜，經(jīng)主動(dòng)脈進(jìn)行Langendorff灌流。用無(wú)鈣液經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流約6 min，再用酶溶液0.4 g·L－1collagenase和0.06 g·L－1protease灌流 25 min直至心臟變得柔軟，松弛。整個(gè)灌流過(guò)程中保持37℃恒溫，持續(xù)通95%O2和5%CO2混合氣。剪下心肌，在 KB液（85 KOH，50 L-glutamic acid，30 KCl， 30 KH2PO4， 20 taurine， 1.0 MgCl2， 10 HEPES，1 EGTA，10 glucose）中輕柔吹打，直至大量細(xì)胞分離下來(lái)，得到細(xì)胞混懸液，貯存于4℃KB液中［4］。

1.4 鈣電流記錄 采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄心肌細(xì)胞鈣電流，室溫下進(jìn)行。所用微電極用兩步拉制儀拉制而成，微電極充電極內(nèi)液（mmol·L－1：150 CsCl，15 EGTA，1 MgCl2，5 MgATP，5 HEPES，CsOH調(diào)至pH7.2）后電阻在2～3 MΩ之間。心室肌細(xì)胞懸液置于浴槽中，靜置2 min貼壁，臺(tái)式液灌流5 min，流速2 ml·min－1。選取胞膜完整、橫紋清晰、桿狀，邊界清楚，無(wú)收縮的心室肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。調(diào)節(jié)微操縱器，將玻璃微電極置于細(xì)胞表面，給予負(fù)壓吸引形成1～10 GΩ的高阻封接，之后加大負(fù)壓使電極尖端部分的膜片破裂，形成全細(xì)胞式記錄方式。本實(shí)驗(yàn)通道電流的記錄均在全細(xì)胞記錄方式形成穩(wěn)定5 min后進(jìn)行，以確保所記錄離子通道電流的穩(wěn)定性。

1.5 過(guò)氧化氫作用模型的建立 通過(guò)轉(zhuǎn)換正常細(xì)胞外液到含過(guò)氧化氫（100μmol·L－1）的正常細(xì)胞外液5～10 min，持續(xù)5 min，灌流速度均維持在6 ml·min－1。

1.6 資料分析及數(shù)據(jù)處理 記錄電流在pCLAMP 8.2軟件中Clampfit 8.2程序里進(jìn)行電流大小的測(cè)量和分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析利用 SPSS 14.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，Illinois 60606，USA），多個(gè)藥物濃度給藥前后結(jié)果比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu) 倒置顯微鏡下可見(jiàn)分離的單個(gè)心室肌細(xì)胞，存活率約70%～80%，結(jié)構(gòu)清晰，橫紋明顯，表面干凈，呈長(zhǎng)桿狀（Fig 1）。

Fig 1 Cell morphology of isolated rat ventricular myocytes

2．2 過(guò)氧化氫作用后20 min內(nèi) ICa，L的“rundown”現(xiàn)象 電流（I）的強(qiáng)度衰減變化率用峰電流Imax與去極化200 ms時(shí)穩(wěn)態(tài)電流的差值和峰電流Imax的比值來(lái)表示。心肌細(xì)胞（n＝6）破膜后過(guò)氧化氫分別作用5、10、15、20 min鈣電流抑制率變化（%），見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Attenuating changes of Ca2＋-currents（I peak）within 20 min（%）

2．3 F2對(duì)過(guò)氧化氫作用大鼠心室肌細(xì)胞ICa，L的影響 為排除所引 ICa，L中 K＋、Na＋電流的干擾，記錄ICa，L的細(xì)胞外液中以TEA-Cl和CsCl分別取代NaCl和KCl，電極內(nèi)液亦用 Cs＋取代 K＋。鉗制電壓（holding potential）設(shè)置為 －40 mV，以失活 T-型鈣通道和鈉通道。以0.2 Hz的刺激頻率，300 ms的方波以10 mV遞增去極化到－30 mV～＋70 mV，引出內(nèi)向電流后加入37.5μl 0.2 mmol·L－1維拉帕米，電流被抑制，表明所檢測(cè)電流為 ICa，L。從 ICa，L的 I-V關(guān)系曲線可知，ICa，L在去極化至＋10 mV左右達(dá)最大，反轉(zhuǎn)電位在＋60 mV～＋70 mV之間（Fig 2）。結(jié)果表明過(guò)氧化氫作用后心室肌細(xì)胞ICa，L峰值明顯增大。F2（0.1、1、10μmol·L－1）濃度依賴地抑制過(guò)氧化氫所致 ICa，L增大，其抑制率分別為（37.50±2.81）%，（54.83±2.93）%，（70.21±2.03）%（P＜0.05）。在－40 mV鉗制電壓條件下，以10 mV為階躍，自－30～70 mV給予測(cè)試電壓，記錄各測(cè)試電壓下ICa，L，以電流峰值對(duì)測(cè)試電壓作圖，得到鈣電流I-V曲線（Fig 2）。過(guò)氧化氫作用后鈣電流I-V曲線下降，形狀無(wú)變化，提示過(guò)氧化氫作用后心室肌細(xì)胞 ICa，L內(nèi)流增大，F(xiàn)2作用后 ICa，LI-V曲線上移。

Fig 2 Effect of F2 on I Ca，L during H 2 O2 exposure

3 討論

目前對(duì)離子通道的研究通常采用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)直接觀察研究通道電流的變化。我們課題組先前膜片鉗實(shí)驗(yàn)觀察了F2對(duì)正常生理狀態(tài)下L型鈣通道及鉀通道的作用，發(fā)現(xiàn)F2能濃度依賴地抑制鈣通道和鉀通道［5－6］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立過(guò)氧化氫模型來(lái)模擬心肌缺血／再灌注，觀察此過(guò)程中ICa，L的變化。為了準(zhǔn)確記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中F2對(duì)L-型鈣通道的阻斷作用，首先觀察了鈣電流記錄過(guò)程中常見(jiàn)的鈣電流衰減現(xiàn)象（“rundown”現(xiàn)象）［7－9］。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫作用心肌細(xì)胞后對(duì)L型鈣通道電流的衰減情況影響較大，因此本實(shí)驗(yàn)記錄過(guò)氧化氫作用后鈣電流20 min內(nèi)的衰減變化情況，發(fā)現(xiàn)其衰減情況并不嚴(yán)重影響到藥物對(duì)通道電流的作用。但是40 min后ICa，L衰減明顯。因此我們選定過(guò)氧化氫作用15 min開(kāi)始記錄鈣電流。此外，為了保證在記錄電流期間出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)效應(yīng)比較穩(wěn)定，我們?cè)陔姌O內(nèi)液中加入了高濃度的EGTA（10 mmol·L－1）和 ATP（5 mmol·L－1），這樣可保證電流在記錄時(shí)間內(nèi)衰減不明顯。

在心肌缺血／再灌注過(guò)程中，大量產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，參與I／R病理過(guò)程，并在其中發(fā)揮著重要作用。氧自由基可導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷，過(guò)氧化氫作為其中一種相對(duì)穩(wěn)定的氧自由基，能快速擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞并引起一系列細(xì)胞功能的改變，其標(biāo)志是動(dòng)作電位時(shí)程的延長(zhǎng)，L-型鈣通道的明顯開(kāi)放［10－11］。大量的Ca2＋通過(guò)開(kāi)放的鈣通道進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞內(nèi)的Ca2＋濃度增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞鈣超載。本研究顯示過(guò)氧化氫引起L-型鈣通道電流的明顯增大，增大率為（33.65±1.90）%，且鈣電流I-V曲線下降。F2阻斷過(guò)氧化氫所致的心肌細(xì)胞膜明顯開(kāi)放的L-型鈣通道，ICa，LI-V曲線上移。前期研究發(fā)現(xiàn)F2具有阻斷正常狀態(tài)下心肌細(xì)胞L-型鈣通道及具有拮抗I／R心肌氧化應(yīng)激的作用［12－14］，綜合本研究結(jié)果，我們有理由推測(cè)F2對(duì)過(guò)氧化氫作用狀態(tài)下心肌細(xì)胞L-型鈣通道可能具有直接及間接的調(diào)整作用。

綜上所述，F(xiàn)2抑制過(guò)氧化氫作用引起的心肌細(xì)胞ICa，L的增大，減少病理狀態(tài)下鈣離子內(nèi)流，降低胞內(nèi)鈣離子濃度，從而發(fā)揮對(duì)缺血心肌組織的保護(hù)作用。這提示F2對(duì)調(diào)節(jié)氧自由基紊亂和改善心肌鈣穩(wěn)態(tài)有重要作用并有著較好的開(kāi)發(fā)前景。

參考文獻(xiàn)：

［1］Zhou Y，Shi G，Zheng J，et al.The protective effects of Egr-1 antisense oligodeoxyribonucleotide on cardiac microvascular endothelial injury induced by hypoxia-reoxygenation［J］.Biochem Cell Biol，2010，88（4）：687－95.

［2］Huang Z，Li H，Guo F，et al.Egr-1，the potential target of calcium channel blockers in cardioprotection with ischemia／reperfusion injury in rats［J］.Cell Physiol Biochem，2009，24（1-2）：17－24.

［3］Zhou Y，Zhang Y，Gao F，et al.N-n-butyl haloperidol iodide protects cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia／reoxygenation injury by down-regulating Egr-1 expression［J］.Cell Physiol Biochem，2010，26（6）：839－48.

［4］劉妍妍，白云龍，王 濤，等.白藜蘆醇對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞L型鈣通道的影響 ［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23（2）：181－4.

［4］Liu Y Y，Bai Y L，Wang T，et，al.Effects of resvertrol on L-type calcium channles of guinea pig ventricular myocytes［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23（2）：181－4.

［5］高分飛，石剛剛，鄭錦鴻，等.碘化N-正丁基氟哌啶醇對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞膜鉀通道的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23（7）：891－5.

［5］Gao F F，Shi G G，Zheng J H，et al.Effects of N-n-butyl haloperidol iodide on on rat myocardial potassium channels［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23（7）：891－5.

［6］黃展勤，石剛剛，鄭錦鴻，等.碘化N-正丁基氟哌啶醇對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣通道的阻斷作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22（6）：702－5.

［6］Huang Z Q，Shi GG，Zheng JH，et al.Effects of N-n-butyl haloperidol iodide on on rat myocardial L-type calcium channels［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22（6）：702－5.

［7］Bers D M，Perez-Reyes E.Ca channels in cardiac myocytes：structure and function in Ca influx and intracellular Ca release［J］.Cardiovasc Res，1999，42（2）：339－60.

［8］Zhen X G，Xie C，Yamada Y，et al.A singleamino acid mutation attenuates rundown of voltage-gated calcium channels［J］.FEBS Lett，2006，580（24）：5733－8.

［9］Xu JJ，Hao L Y，Kameyama A，et al.Calmodulin reverses rundown of L-type Ca（2＋）channels in guinea pig ventricular myocytes［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2004，287（6）：C1717－24.

［10］Ward CA，Giles WR.Ionic mechanism of the effects of hydrogen peroxide in rat ventricular myocytes［J］.JPhysiol，1997，500（Pt 3）：631－42.

［11］Thomas G P，Sims SM，Cook M A，et al.Hydrogen peroxide-induced stimulation of L-type calcium current in guinea pig ventricular myocytes and its inhibition by adenosine A1 receptor activation［J］.J Pharmacol Exp Ther，1998，286（3）：1208－14.

［12］Huang Z，Shi G，Gao F，et al.Effects of N-n-butyl haloperidol iodide on L-type calcium channels and intracellular free calcium in rat ventricular myocytes［J］.Biochem Cell Biol，2007，85（2）：182－8.

［13］Gao F F，Hao SY，Huang Z Q，et al.Cardiac electrophysiological and antiarrhythmic effects of N-n-butyl haloperidol iodide［J］.Cell Physiol Biochem，2010，25（4－5）：433－42.

［14］Huang Z Q，Shi GG，Zheng JH，et al.Effects of N-n-butyl haloperidol iodide on rat myocardial ischemia and reperfusion injury and L-type calcium current［J］.Acta Pharmacol Sin，2003，24（8）：757－63.