柱前衍生化RP—HPLC測定雞內(nèi)金中16種氨基酸的含量

梁琨+張丹+史輯+胡泓+修彥鳳+賈天柱

[摘要] 采用酸水解法制備水解氨基酸樣品溶液，以異硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生化后進(jìn)行HPLC分析。采用Ultimate Prime C₁₈色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A 0.1 mol·L^-1醋酸鈉溶液（調(diào)pH至6.5）-乙腈（93∶7），流動相B乙腈-水（8∶2）；流速1.0 mL·min^-1；柱溫40 ℃；檢測波長254 nm；梯度洗脫。氨基酸衍生溶液在36 h內(nèi)保持穩(wěn)定，16種氨基酸線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，加樣回收率在98.01%～101.8%。該方法操作簡便，精密度和重復(fù)性良好，可用于雞內(nèi)金中16種水解氨基酸含量的測定。

[關(guān)鍵詞] 雞內(nèi)金；氨基酸；衍生化；異硫氰酸苯酯；高效液相色譜

[收稿日期] 2013-10-10

[基金項(xiàng)目] 國家藥品標(biāo)準(zhǔn)科研項(xiàng)目；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13ZR1442000）

[通信作者] 修彥鳳，副教授，E-mail：xiuyf@hotmail.com

[作者簡介] 梁琨，講師， E-mail：dolphin000000@163.com

雞內(nèi)金為雉科動物家雞 Gallus gallus domesticus Brisson的干燥沙囊內(nèi)壁。殺雞后取出雞肫，立即剝下內(nèi)壁，洗凈，干燥。雞內(nèi)金性味甘，平，歸脾、胃、小腸、膀胱經(jīng)。具有健胃消食、澀精止遺、通淋化石的功效，用于食積不消、嘔吐瀉痢、小兒疳積遺尿、遺精、石淋澀痛、膽脹脅痛。近年來，隨著雞內(nèi)金在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛，對雞內(nèi)金的質(zhì)量提出了更高的要求，而《中國藥典》2010年版僅以醇溶性浸出物和灰分為指標(biāo)，沒有指標(biāo)成分的含量測定。

現(xiàn)代研究表明，雞內(nèi)金主要含有蛋白質(zhì)、多種氨基酸、維生素和微量元素等。氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位和生物代謝過程中的重要物質(zhì)，是人體的必需營養(yǎng)成分之一。筆者利用PITC柱前衍生化方法針對雞內(nèi)金中16種氨基酸類成分進(jìn)行了測定。

1 材料

Agilent HPLC1100系統(tǒng)：四元泵、真空在線脫氣機(jī)、二極管陣列檢測器（DAD）、Agilent ChemStation 工作站；BT25S電子天平（1/10萬，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；FE20 pH計(jì)（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。

16種氨基酸對照品，批號分別為L-天冬氨酸（Asp）110103，L-谷氨酸（Glu）110109，L-絲氨酸（Ser）120116，L-甘氨酸（Gly）120301，L-組氨酸（His）120112，L-精氨酸（Arg）101201，L-蘇氨酸（Thr）120113，L-丙氨酸（Ala）120117，L-脯氨酸（Pro）100311，L-酪氨酸（Tyr）120201，L-纈氨酸（Val）120113，L-蛋氨酸（Met）110125，L-異亮氨酸（Ile）110801，L-亮氨酸（Leu）120117，L-苯丙氨酸（Phe）090712，L-賴氨酸（Lys）100423，以上對照品均購自上海友思生物技術(shù)有限公司，純度均≥98%；10批雞內(nèi)金分別購買于安徽（1）、湖南（2）、浙江（3）、上海（4）、內(nèi)蒙古（5）、廣東（6）、江蘇（7）、云南（8）、河北（9）、山東（10），由上海中醫(yī)藥大學(xué)修彥鳳副教授鑒定為雉科動物家雞G. gallus domesticus的干燥沙囊內(nèi)壁。

異硫氰酸苯酯（PITC）純度標(biāo)示量為97.0%（Alpha Aesar 公司）；乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；醋酸鈉、三乙胺、鹽酸、正己烷、冰醋酸均為分析純，購于國藥集團(tuán)上海公司；純凈水為Milli-Q純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

Ultimate Prime C₁₈色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A 0.1 mol·L^-1醋酸鈉溶液（以冰醋酸調(diào)pH為6.5）-乙腈（93∶7），流動相B乙腈-水（8∶2），梯度洗脫程序見表1；流速1.0 mL·min^-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；檢測波長254 nm。

2.2 溶液的制備及衍生化

2.2.1 混合對照品儲備溶液的制備 精密稱取16種氨基酸對照品于量瓶中，用0.1 mol·L^-1鹽酸溶液定容，配制成每1 mL分別含L-天冬氨酸（Asp）0.329 2 mg，L-谷氨酸（Glu）0.332 8 mg，L-絲氨酸（Ser）0.262 0 mg，L-甘氨酸（Gly）0.283 6 mg，L-組氨酸（His）0.392 8 mg，L-精氨酸（Arg）0.438 0 mg，L-蘇氨酸（Thr）0.291 6 mg，L-丙氨酸（Ala）0.224 4 mg，L-脯氨酸（Pro）0.293 2 mg，L-酪氨酸（Tyr）0.449 6 mg，L-纈氨酸（Val）0.290 4 mg，L-蛋氨酸（Met）0.368 8 mg，L-異亮氨酸（Ile）0.331 2 mg，L-亮氨酸（Leu）0.327 6 mg，L-苯丙氨酸（Phe）0.409 2 mg，L-賴氨酸（Lys）0.369 2 mg的混合對照品儲備溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 雞內(nèi)金干燥樣品粉碎成細(xì)粉，取0.1 g，精密稱定，置安瓿中，加入水解液（含0.5%苯酚的50%鹽酸溶液）5 mL，置氮吹儀下吹氮?dú)?5 min，熔封安瓿，置于110 ℃烘箱內(nèi)水解24 h，取出放冷至室溫后開封，精密吸取水解液1.0 mL，置于蒸發(fā)皿中水浴蒸干，殘?jiān)?.1 mol·L^-1鹽酸溶解定容至10 mL。endprint

2.2.3 PITC衍生化樣品的制備[1-2] 量取上述混合對照品溶液、供試品溶液和0.1 mol·L^-1鹽酸空白溶液各1.00 mL于10 mL離心管內(nèi)，精密加入0.1 mol·L^-1PITC乙腈溶液和1 mol·L^-1三乙胺乙腈溶液各0.50 mL，混勻后室溫放置1 h，加正己烷4.00 mL，渦旋1 min，放置10 min，下層溶液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，備用。

2.3 線性關(guān)系考察

精密移取2.2.1項(xiàng)下混合對照品儲備溶液0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，10.00，12.50 mL于25 mL量瓶中，用0.1 mol·L^-1鹽酸定容，按2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖。以峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，16種氨基酸在各自線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)見表2。

2.4 精密度考察

精密量取對照品溶液，按確定的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算16種氨基酸濃度的精密度，RSD分別為Asp 1.3%，Glu 1.4%，Ser 0.99%，Gly 1.2%，His 1.5%，Arg 0.95%，Thr 0.93%，Ala 1.1%，Pro 1.0%，Tyr 1.2%，Val 1.4%，Met 1.1%，Ile 1.4%，Leu 1.5%，Phe 1.3%，Lys 1.2%，說明該實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性考察

取3號樣品的供試品溶液，按上述色譜條件分別于0，4，8，12，24，36 h進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算16種氨基酸濃度的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，除Pro和Met 2種氨基酸RSD略大于3.0%外，其余種氨基酸在36 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD分別為Asp 0.93%，Glu 1.1%，Ser 2.9%，Gly 2.8%，His 0.88%，Arg 2.9%，Thr 2.4%，Ala 1.4%，Pro 3.9%，Tyr 0.42%，Val 0.83%，Met 3.5%，Ile 0.43%，Leu 2.0%，Phe 1.2%，Lys 0.34%。

2.6 重復(fù)性考察

取3號樣品6份，每份約100 mg，精密稱定，按2.2.2和2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液并衍生化，依上述色譜條件測定16種氨基酸濃度RSD分別為Asp 1.7%，Glu 1.8%，Ser 1.1%，Gly 0.77%，His 1.8%，Arg 0.64%，Thr 1.2%，Ala 0.47%， Pro 0.98%，Tyr 0.55%，Val 0.23%，Met 1.1%，Ile 0.59%，Leu 0.70%，Phe 0.76%，Lys 0.63%，RSD均小于3.0%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取3號樣品9份于安瓿內(nèi)，每份約50 mg，精密稱定，平行分為3組，每組分別加入氨基酸對照品的量約為樣品中含量的80%，100%，120%，置安瓿中，按2.2.2和2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液并衍生化，根據(jù)所得峰面積計(jì)算16種氨基酸的平均回收率（n=9）（RSD）分別為Asp 100.0%（4.0%），Glu 98.01%（3.4%），Ser 101.1%（4.6%），Gly 100.8%（4.4%），His 101.7%（2.6%），Arg 99.66%（3.6%），Thr 98.46%（2.6%），Ala 98.70%（4.8%），Pro 101.6%（3.2%），Tyr 98.81%（3.5%），Val 98.17%（3.4%），Met 100.7%（2.2%），Ile 99.14%（3.0%），Leu 100.7%（3.6%），Phe 100.8%（3.8%），Lys 101.8%（2.6%）。

2.8 樣品測定

在上述色譜條件下測定16種氨基酸衍生物各峰間的分離度均大于1.5。16種氨基酸空白溶液、對照品溶液和樣品溶液的高效液相色譜圖見圖1。取雞內(nèi)金樣品10個批次，按2.2.2和2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液并衍生化，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算16種氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg·g^-1）見表3。

3 討論

早期的氨基酸分析是通過離子交換樹脂分離，再進(jìn)行柱后衍生化反應(yīng)，以紫外檢測器檢測，但分析時間長，操作復(fù)雜，靈敏度低?，F(xiàn)行氨基酸測定一般都用氨基酸自動分析儀測定，但氨基酸自動分析儀器昂貴，分析時間長，且只能用于分析氨基酸，限制了氨基酸分析技術(shù)的廣泛應(yīng)用。近年出現(xiàn)的柱前衍生化RP-HPLC 分析法具有高靈敏度、低檢測限和簡便可靠等特點(diǎn)，因而廣為使用[1]。該方法通常無需考慮衍生反應(yīng)的動力學(xué)因素，衍生化試劑、反應(yīng)條件和反應(yīng)時間的選擇不受色譜系統(tǒng)的限制，不需附加儀器設(shè)備，已有逐漸取代氨基酸自動分析儀的趨勢。目前已經(jīng)報(bào)道的用于氨基酸柱前衍生的衍生試劑主要有異硫氰酸苯酯[2]、2，4-二硝基氟苯[3]、鄰苯二甲醛[4]、氯甲酸芴甲酯[5]、丹磺酰氯[6]及6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯[7]等。其中異硫氰酸苯酯（PITC）與一級氨基酸和二級氨基酸均能反應(yīng)，生成有紫外響應(yīng)的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸經(jīng)反相高效液相色譜分離后用紫外檢測，在一定的范圍內(nèi)其吸光值與氨基酸濃度成正比。PTC-氨基酸的穩(wěn)定性好，該方法為目前氨基酸分析中具有吸引力的分析方法之一。

本文采用異硫氰酸苯酯柱前衍生化RP-HPLC 法對10批雞內(nèi)金中的氨基酸進(jìn)行了含量測定，衍生化試劑對各組分峰的測定無干擾，且生成的衍生物十分穩(wěn)定。該方法的精密度高，重復(fù)性良好，可用于雞內(nèi)金中16種氨基酸的含量測定。endprint

氨基酸無紫外吸收，因此衍生化反應(yīng)要充分，才能將氨基酸檢測完全。衍生化試劑PITC保存時要防止與水接觸， 且其會降低分析柱的壽命，衍生化后需要用正己烷萃取， 以盡量將其除去。氨基酸為兩性物質(zhì)， pH 對其分離度影響大，因此要保證流動相pH 的準(zhǔn)確與穩(wěn)定。

色氨酸的測量需要堿水解條件，無法與其他氨基酸同時測量，故本文未做測量。雞內(nèi)金水解液中半胱氨酸含量極低，幾乎未檢出，本文也未做測量。蛋白質(zhì)的水解條件較為激烈，某些不穩(wěn)定氨基酸（Ser，Thr，Met）會出現(xiàn)不同程度的降解[1]，為防止和減緩部分不穩(wěn)定氨基酸的降解，水解前在樣品中滴入幾滴苯酚，也可有效幫助樣品被鹽酸溶液潤濕，使水解充分。文獻(xiàn)[1]采用水解方法在150 ℃水解1 h，但由于本實(shí)驗(yàn)所用安瓿在150 ℃時爆裂，故采用較溫和的條件，于110 ℃水解24 h，以保證水解完全。

異硫氰酸苯酯具有較強(qiáng)毒性，操作時應(yīng)在通風(fēng)處內(nèi)進(jìn)行，盡可能佩戴全面罩（或佩戴眼罩及口罩），戴橡膠手套。剩余的異硫氰酸苯酯乙腈溶液置廢液桶，以免污染水體。

氨基酸的平均含量為41.5%，各種氨基酸的大小依次為精氨酸>亮氨酸>酪氨酸>纈氨酸>天冬氨酸>蘇氨酸>谷氨酸>異亮氨酸>甘氨酸>苯丙氨酸>丙氨酸>絲氨酸>脯氨酸>賴氨酸>蛋氨酸>組氨酸。雞內(nèi)金既可藥用也可食用，天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸為鮮味氨基酸，蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和組氨酸為必需氨基酸，其中必需氨基酸占氨基酸總量的43.1%， 鮮味氨基酸含量占氨基酸總量的37.5%。

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Determination of amino acids in Galli Gigerii Endothelium Corneum by

HPLC with pre-column derivatization

LIANG Kun， ZHANG Dan ， SHI Ji， HU Hong， XIU Yan-feng， JIA Tian-zhu

（1.Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China；

2. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China）

[Abstract] Hydrolytic amino acids were extracted by acid hydrolysis method， then derivatized with phenyl isothiocyanate （PITC）. And the samples were analysed by HPLC on an Ultimate Prime C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）column with gradient elution of 0.1 mol·L^-1sodium acetate buffer solution （adjusted to pH 6.5）-acetonitrile （93∶7） （A） and acetonitrile-water （8∶2） （B） at a flow rate of 1.0 mL·min^-1. Column temperature was 40 ℃ and the detected wavelength was 254 nm. Amino acids derivative solution remained stable in 36 hours. The response was linear for 16 amino acids with a correlation coefficient r>0.999 5. The average recoveries were 98.01%-101.8%. The method is reliable with good accuracy and repeatability， which is useful for the determination of amino acids in Galli Gigerii Endothelium Corneum.

[Key words] Galli Gigerii Endothelium Corneum； amino acids； derivatization； phenyl isothiocyanate （PITC）； HPLC

doi：10.4268/cjcmm20140820

[責(zé)任編輯 孔晶晶]endprint