豚鼠ESR2基因新的可變剪接體克隆及序列分析

司景磊　李龍　陳秋明　郭曉萍　郭亞芬　蔣欽楊

摘要：【目的】對豚鼠雌激素受體2（ESR2）基因進行克隆及序列分析，并預測分析其編碼的蛋白序列，為提高豚鼠產(chǎn)仔性能及其育種打下基礎?！痉椒ā扛鶕?jù)GenBank已公布的豚鼠ESR2基因序列（登錄號XM_003472337）設計引物，以豚鼠卵巢組織總RNA為模板，RT-PCR擴增ESR2基因編碼區(qū)序列（CDS），利用生物信息學分析其編碼蛋白氨基酸的組成及理化性質(zhì)、二級結構及與相關物種的同源性?！窘Y果】克隆獲得的豚鼠ESR2基因CDS長度為1650 bp，編碼549個氨基酸，比參照序列（XM_003472337）少54個堿基，是ESR2基因新的可變剪接體，且第7外顯子缺失；蛋白質(zhì)二級結構預測結果表明，豚鼠ESR2成熟肽包含α螺旋、β折疊和無規(guī)卷曲3種二級結構元件，由于缺失18個氨基酸導致蛋白質(zhì)結構發(fā)生變異；同源性分析結果顯示，豚鼠與長尾龍貓、奧氏更格盧鼠、馬、達馬拉鼴鼠、裸鼢鼠、鼠狐猴、八齒鼠、豬和人的ESR2基因序列同源性分別為91%、87%、86%、91%、92%、86%、88%、92%和86%?！窘Y論】克隆獲得的豚鼠ESR2基因為新的可變剪接體，可作為研究豚鼠產(chǎn)仔性能及豚鼠育種重要的候選基因之一。

關鍵詞： 豚鼠；產(chǎn)仔性能；ESR2基因；克?。恍蛄蟹治?/p>

中圖分類號： S865.1+1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）05-0731-05

Abstract：【Objective】ESR2 gene of Cavia porcellus was cloned， its sequence was analyzed， and the coded protein structure was predicted and analyzed， in order to provide references for further research on farrowing performance and breeding of C. porcellus. 【Method】According to C. porcellus ESR2 gene sequence（accession no. XM_003472337） published in GenBank， a pair of primers was designed to amplify ESR2 gene coding sequence（CDS） of C. porcellus using RT-PCR. Then the obtained fragments were sequenced and indentified. The physicochemical properties and protein secondary structure of ESR2 was predicted and analyzed using bioinformatics software. 【Result】The CDS of cloned ESR2 gene in C. porcellus was 1650 bp in length， encoding 549 amino acids， and which differed with reference sequence（accession no. XM_003472337） owing to its lack of 54 bases. Therefore， it was speculated that the cloned sequence was a new alternative splicing of ESR2 gene， lacking the 7th exon. In addition， the prediction results of protein secondary structure showed that， C. porcellus ESR2 mature peptide contained three secondary structure elements， which were α helix， β fold， and random coil. ESR2 of C. porcellus shared amino acid sequence homologies of 91%， 87%， 86%， 91%， 92%， 86%， 88%， 92%， 86% with those of Chinchilla lanigera， Dipodomys ordii， Equus caballus， Fukomys damarensis， Homo sapiens， Microcebus murinus， Octodon degus and Sus scrofa， respectively. 【Conclusion】The cloned ESR2 gene of C. porcellus is a new alternative splicing， and can be used as one of candidate genes for further research on farrowing performance and breeding of C. porcellus. C. porcellus has the closest genetic relationship with H. glaber and O. degus， and the farthest genetic relationship with Sus scrofa and Homo sapiens.

Key words： Cavia porcellus； farrowing performance； ESR2 gene； clone； sequence analysis

0 引言

【研究意義】雌激素受體（Estrogen receptor，ESR）是類固醇受體超家族的主要成員之一，具有調(diào)控轉錄蛋白的重要功能，對雌激素基因的調(diào)控和表達具有重要作用，是最早被發(fā)現(xiàn)并用于調(diào)控動物繁殖性狀的候選基因（胡建偉等，2014）。通過ESR介導，雌激素刺激雌性動物的性腺，引起第二性征發(fā)育及繁殖周期的變化，維持其生殖力，且在妊娠時可刺激垂體分泌和釋放黃體生成素（Luteinizing hormone，LH），即ESR與雌激素的生物學作用密切相關（陳克飛等，2000；Findlay et al.，2000；毛永江和丁家桐，2003）。通過分析豚鼠ESR基因序列，有助于深入研究ESR基因?qū)ζ洚a(chǎn)仔數(shù)的影響，揭示其分子調(diào)節(jié)機制，對有效提高豚鼠的繁殖性狀具有重要意義。【前人研究進展】目前，已有較多關于ESR基因的研究報道。Jenson和Jacobson于1962年在陰道和子宮等靶組織中首次發(fā)現(xiàn)ESR基因（王懷禹，2010）；Walter等（1985）研究發(fā)現(xiàn)，人類的ESR2基因在許多組織中均有表達，其中以子宮、卵巢等組織中的表達量較高，其前體蛋白含530個氨基酸，在結構上可分為6個結構區(qū)，在功能上可分為4個結構域；Green等（1986）、Enmark等（1998）研究發(fā)現(xiàn)，人類的ESR基因位于第6染色體，其cDNA閱讀框架包含1788個核苷酸，編碼595個氨基酸，約跨越140 kb的區(qū)域；Kumar等（1986）、Leung等（2006）研究表明，ESR2的不同功能結構域呈現(xiàn)不同生理作用，其中第三結構域為DNA結合結構域，第五和第六結構域為激素結合結構域，這些功能結構域會引起受體蛋白構象的改變，從而調(diào)控靶基因轉錄；Kuiper等（1996）將哺乳動物ESR基因分為ESR1和ESR2兩種亞型，并由不同基因編碼；Rothschild等（1996）研究證實，ESR基因是影響豬產(chǎn)仔數(shù)的主效基因或是與影響豬產(chǎn)仔數(shù)主效基因緊密的連鎖標記；鄧小華等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，雌性大鼠的大腦及下丘腦視前區(qū)均有雌激素受體神經(jīng)元分布，且ESR基因主要分布于梨形核、下丘腦內(nèi)視前區(qū)、弓狀核等器官；段煉等（2011）研究發(fā)現(xiàn)ESR是影響豬產(chǎn)仔數(shù)的主效基因?！颈狙芯壳腥朦c】由于豚鼠對藥物及細菌等病原菌較敏感，且個體較小、性情溫順，是理想的實驗動物模型，但豚鼠的窩產(chǎn)仔數(shù)少（2～3只）、妊娠期長（62～72 d），遠不能滿足實驗需求，而且目前國內(nèi)鮮見有關ESR2基因?qū)﹄嗍螽a(chǎn)仔性狀影響的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】對豚鼠ESR2基因進行克隆及序列分析，并預測和分析其編碼的蛋白質(zhì)，為后期開展ESR2基因表達對豚鼠繁殖性狀的影響打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

雌性豚鼠由廣西大學動物科學技術學院動物遺傳與育種實驗室提供，發(fā)育正常、性成熟且無重病史，無菌采集其卵巢組織樣品，置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩rizol試劑、DNA膠回收純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；酵母浸出物、胰蛋白胨購自英國OXOID公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞由廣西大學動物科學技術學院動物遺傳育種實驗室保存；pMD18-T載體購自TaKaRa公司；Taq DNA合成酶購自廣州東盛生物科技有限公司。

1. 2 引物設計與合成

根據(jù)GenBank已公布的豚鼠ESR2基因序列（登錄號XM_003472337），采用Oligo 7.0軟件設計特異性的引物（P1：5'-ATGTCTCTTTGTGCCCCTT-3'；P2：5'-CC

ATAGATAAGAACCGGCG-3'），目的片段為1650 bp。引物由深圳華大基因科技有限公司合成。

1. 3 總RNA提取

采用Trizol法提取豚鼠卵巢組織總RNA，利用核酸儀檢測總RNA的純度和濃度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。

1. 4 目的片段克隆

RT-PCR反應體系25.0 μL：PrimeScriptTM 1 Step Enzyme Mix l.0 μL，2×1 Step Buffer 12.5 μL，RNA模板2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，Rnase Free dH2O補足至25.0 μL。擴增程序：50 ℃反轉錄30 min；94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s，58.5 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進行27個循環(huán)；72 ℃終延伸90 s。

1. 5 陽性克隆驗證

將PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按照膠回收純化試劑盒說明回收目的片段，將目的基因連接至pMD18-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素的LA培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。10 h后挑取轉化子進行菌液PCR驗證，將陽性轉化子送至深圳華大基因科技有限公司進行測序。

1. 6 序列分析和生物信息學分析

應用Lasergene 7.0對測序結果進行序列比對，以MEGA 6.0對其進行同源性分析，同時利用ExPASy數(shù)據(jù)庫中的ProtParam預測ESR2基因編碼蛋白的氨基酸組成和理化性質(zhì)。

2 結果與分析

2. 1 總RNA提取結果

豚鼠卵巢組織總RNA的電泳結果如圖1所示，28S、18S和5S條帶清晰可見，表明提取的總RNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)的基因克隆。

2. 2 ESR2基因擴增結果

通過RT-PCR擴增ESR2基因，電泳結果如圖2所示，單一的條帶清晰可見，約1600 bp，大小與預期結果相符。

2. 3 陽性克隆的驗證結果

將PCR產(chǎn)物純化回收后連接至pMD18-T載體，將重組載體轉化大腸桿菌DH5α，挑取轉化子進行菌液PCR驗證，擴增的基因片段約1600 bp（圖3），與預期結果相符，表明所挑選轉化子為陽性。

2. 4 序列分析結果

利用DNASTAR生物軟件中的MegAlign對測序結果進行分析，結果表明，克隆獲得的ESR2基因CDS全長1650 bp，與GenBank已公布的豚鼠ESR2基因序列（登錄號XM_003472337）相比，在1150～1203位點缺失54個堿基，其他位點未發(fā)生突變（圖4）。開放閱讀框分析結果表明，克隆獲得的ESR2基因編碼549個氨基酸（圖5），與參考序列（XM_003472337）的氨基酸序列相比缺失18個氨基酸。因此，推測克隆獲得的ESR2基因可能為新的可變剪接體。豚鼠ESR2基因應有11個外顯子，所獲得的新可變剪接體為第7個外顯子缺失。

2. 5 蛋白質(zhì)結構分析結果

利用ExPASy數(shù)據(jù)庫中的ProtParam預測ESR2基因編碼蛋白的氨基酸組成和理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其含549個氨基酸，包含20種常用的氨基酸，其中絲氨酸（12.2%）、亮氨酸（11.84%）和甘氨酸（8.5%）含量較多，精氨酸（5.28%）、色氨酸（1.28）和組氨酸（3.64%）含量較少，且以色氨酸含量最少。利用Protein Model Portal（PMP）軟件預測豚鼠ESR蛋白二級結構，該可變剪接體蛋白92處附近殘基疏水性較強（分值為2.067），379處附近殘基的親水性較強（分值為0.289）。成熟肽包含有α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲3種二級結構元件，結果如圖6所示，該可變剪接體為第7外顯子缺失，缺失18個氨基酸導致蛋白質(zhì)結構發(fā)生變異。

2. 6 ESR2基因同源性分析及系統(tǒng)進化樹構建

將克隆獲得的豚鼠ESR2基因序列與其他物種進行同源比對并建立物種系統(tǒng)進化樹（圖7），結果顯示，豚鼠與長尾龍貓（Chinchilla lanigera，XM_005399138）、奧氏更格盧鼠（Dipodomys ordii，XM_013014401）、馬（Equus caballus， NM_001309479）、達馬拉鼴鼠（Fu-

komys damarensis， XM_010603004）、裸鼢鼠（Heterocephalus glaber， XM_004837415）、人（Homo sapiens AB006590）、鼠狐猴（Microcebus murinus， XR_001157

315）、八齒鼠（Octodon degus， XM_004624792）、豬（Sus scrofa， AF267736.1）的同源性分別為91%、87%、86%、91%、92%、86%、88%、92%和86%。其中，與豚鼠遺傳距離最近的是裸鼢鼠和八齒鼠，最遠的是人類和豬，符合進化規(guī)律。

3 討論

真核生物中幾乎每個基因含有多個內(nèi)含子和外顯子，經(jīng)轉錄生成mRNA前體，通過不同的剪接方式形成不同剪接異構體，稱為可變剪接體（Stamm et al.，2005）。可變剪接體的存在使真核生物蛋白質(zhì)具有多樣性。可變剪接體是一個古老的進化過程，且可能出現(xiàn)在真核生物共同的祖先中，單個外顯子的功能是通過進化選擇來確定（Irimia et al.，2007；Keren et al.，2010）。在進化選擇的過程中，具重要功能的外顯子被保存下來，而無功能的外顯子被刪除或替代（Magen and Ast，2005；Xing and Lee，2005）。ESR是配體激活轉錄因子家族中的一種核酸受體，調(diào)控雌性脊椎動物組織中雌激素基因的表達（狄冉等，2008），自Baltimoer于1980年在小鼠的IgM基因中發(fā)現(xiàn)第一個可變剪接體的產(chǎn)生模型（黨萬太等，2013）以來，大量研究表明，ESR1和ESR2基因也存在可變剪接體（Wimberly et al.，2014）。雖然目前還不能確定這些可變剪接體存在的生物學意義，但可確定其對ESR基因的表達具有一定的調(diào)控作用。在人類的ESR2基因中發(fā)現(xiàn)10種缺失不同外顯子組合的mRNA可變剪接體（Poola et al.，2002），且對乳腺癌細胞增殖具有重要的生物學作用（Sotoca et al.，2012）。關于ESR基因與產(chǎn)仔數(shù)相關的研究多見于豬上，在豚鼠上鮮見報道，本研究對豚鼠ESR2基因進行克隆及序列分析，填補了豚鼠繁殖性能相關基因研究在國內(nèi)的空白。結果顯示，豚鼠ESR2基因CDS全長為1650 bp，編碼549個氨基酸，與GenBank已公布的豚鼠ESR2基因序列相比，無堿基突變，具有高度的保守性，但缺失了54個堿基，表明成功克隆了豚鼠ESR2基因，且所克隆的ESR2基因可能為一種新的可變剪接體。這與王懷禹（2010）研究發(fā)現(xiàn)豬的ESR2基因位于14q22-q24，且編碼530個氨基酸的結果存在差異，其原因可能為不同物種間的差異所造成。然而，該基因堿基缺失是否產(chǎn)生新的功能及其功能對豚鼠造成的影響還需進一步研究。

大量研究證實，ESR2基因在動物體的卵巢和睪丸組織中有較高的表達（Nilsson et al.，2001），對調(diào)控豬和小鼠的產(chǎn)仔性能具有重要作用。Rothschild等（1996）通過候選基因法對含有50%中國梅山豬血緣合成系進行研究，發(fā)現(xiàn)ESR基因與產(chǎn)仔數(shù)主效基因緊密連鎖；Couse等（2001）將小鼠的ESR2基因敲除后，小鼠產(chǎn)仔數(shù)明顯下降，且幼仔的個體較小；丁家桐等（2002）對豬ESR基因的PvuⅡ多態(tài)位點與繁殖性能的相關性開展研究，結果表明，ESR基因型與總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)呈極顯著相關性。據(jù)此推測，豚鼠的窩產(chǎn)仔數(shù)少且妊娠期長的主要原因是ESR2對雌激素基因的調(diào)控和表達所致，應深入研究ESR2基因轉錄表達對雌激素對豚鼠繁殖力調(diào)控的分子機制，為提高豚鼠產(chǎn)仔性能奠定理論基礎。

4 結論

本研究克隆獲得的豚鼠ESR2基因為新的可變剪接體，可作為研究豚鼠產(chǎn)仔性能及豚鼠育種重要的候選基因之一。

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（責任編輯 陳 燕）