維生素D受體基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者的關(guān)聯(lián)研究

劉蒙　趙龍鳳

【摘要】 目的：探討維生素D受體（VDR）FokⅠ基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者臨床表型的關(guān)聯(lián)。方法：應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）技術(shù)檢測(cè)VDR FokⅠ基因的多態(tài)性在44例慢性乙型肝炎重度患者、46例中度患者和40例非活動(dòng)性HBsAg攜帶者中的分布，并進(jìn)行基因型分析。結(jié)果：慢性乙型肝炎重度組、慢性乙型肝炎中度組VDR FokⅠ基因的基因型與對(duì)照組（非活動(dòng)性HBsAg攜帶者）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；慢性乙型肝炎重度組、中度組與對(duì)照組VDR FokⅠ基因酶切位點(diǎn)的等位基因F/f分布存差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Pearson列聯(lián)系數(shù)=0.53，提示等位基因F/f分布與慢性乙型肝炎患者的不同臨床表型存在相關(guān)性。慢性乙型肝炎重度組、中度組f等位基因分布頻率高于對(duì)照組。結(jié)論：VDR FokⅠ基因的多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者的不同臨床表型存在一定的關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】 慢性乙型肝炎； 維生素D受體； 基因多態(tài)性； 免疫調(diào)節(jié)

慢性乙型肝炎（CHB）是以肝細(xì)胞損傷和肝組織炎性反應(yīng)為主的疾病，乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝損傷及轉(zhuǎn)歸與機(jī)體的細(xì)胞免疫密切相關(guān)，主要以T淋巴細(xì)胞清除病毒和肝細(xì)胞的損傷為主[1]。1，25-二羥維生素D3[1，25（OH）2D3]是維生素D3的活性形式[2]。隨著研究的深入，人們認(rèn)識(shí)到它除了調(diào)節(jié)鈣磷代謝外，還具有介導(dǎo)免疫反應(yīng)作用，而這些功能的實(shí)現(xiàn)主要是由維生素D受體（ vitamin D receptor， VDR）來介導(dǎo)的[3]。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）的方法，初步探討VDR基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者不同臨床表型的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月-11月本院感染科住院的慢性乙型肝炎現(xiàn)癥患者90例，其中重度患者44例，男26例，女18例，平均年齡（37.4±12.5）歲；中度患者46例，男29例，女17例，平均年齡（35.4±10.5）歲。對(duì)照組選擇同期本院感染科住院和門診的非活動(dòng)性HBsAg攜帶者40例，其中男27例，女13例，平均年齡（32.5±9.2）歲，全部患者均為生活在本地區(qū)的漢族人群，無血緣關(guān)系。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照“慢性乙型肝炎防治指南2010年更新版”，所有患者在3個(gè)月內(nèi)未使用免疫調(diào)節(jié)劑和抗病毒藥物，并排除合并其他病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化及肝癌等。全部患者均自愿參加本次研究。三組研究對(duì)象一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室檢查 肝功能相關(guān)指標(biāo)，包括AST/ALT、血清總膽紅素TBIL、凝血酶原活動(dòng)度PTA、血清白蛋白；檢測(cè)HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe和anti-HBc及HBV-DNA滴度。

1.2.2 基因組DNA的提取 留取慢性乙型肝炎中度及重度患者和非活動(dòng)性HBsAg攜帶者空腹12 h后，晨起靜脈采血4 mL（EDTA抗凝），采用硅膠柱純化方式，用血液DNA提取試劑盒（D3741-01 美國OMEGA），從700 ?L抗凝血液中提取淋巴細(xì)胞基因組DNA。利用UV計(jì)測(cè)定所提取的DNA濃度及純度，并將其稀釋至10 ng/?L，分裝保存于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP） VDR FokⅠ基因的引物序列：上游引物，5，-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3；下游引物，5，-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3?？偡磻?yīng)體系均為25 μL：1 ?L基因組DNA，2.5 ?L 10×PCR 緩沖液，上下游引物各0.5 μL，dNTPs 2 ?L，0.25 ?L Taq DNA 聚合酶，去離子水18.25 ?L。VDR FokⅠPCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃變性10 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。取擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物0.5 ?L，1 ?L限制性內(nèi)切酶FokⅠ，及2 ?L 10×M Buffer， 2 ?L 0.1% BSA（由大連TaKaRa公司提供）及14.5 ?L滅菌水組成酶切總反應(yīng)體系20 ?L，置于37 ℃水浴1 h，進(jìn)行FokⅠ酶切，將酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，以DL700 Marker為參考，紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) 比較慢性乙型肝炎現(xiàn)癥患者重度組、中度組和對(duì)照組VDR基因多態(tài)性的差異；VDR FokⅠ基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎不同病情程度的關(guān)聯(lián)程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 分別統(tǒng)計(jì)CHB現(xiàn)癥患者重度組、CHB現(xiàn)癥患者中度組和對(duì)照組非活動(dòng)性HBsAg攜帶者基因型和等位基因的分布頻率數(shù)據(jù)，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，P>0.05認(rèn)為資料可靠，代表性好。計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物酶切結(jié)果電泳圖譜 VDR FokⅠ酶切后出現(xiàn)3種結(jié)果：純合子FF為270 bp，1條帶；雜合子Ff為270 bp、195 bp，2條帶；純合子ff為195 bp，1條帶，見圖1。

2.2 VDR FokⅠ基因的基因型和等位基因頻率分布 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)后，結(jié)果顯示符合Hardy-Weinberg平衡，說明資料可靠，代表性好。CHB重度組、中度組VDR FokⅠ基因的基因型與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=34.816，P<0.01）。見表1。CHB重度組、中度組患者與對(duì)照組VDR FokⅠ基因酶切位點(diǎn)的等位基因F/f分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=50.674，P<0.01），Pearson列聯(lián)系數(shù)=0.53，提示等位基因F/f分布與慢性乙型肝炎患者的不同臨床表型存在相關(guān)性。CHB重度組、中度組f等位基因分布頻率高于對(duì)照組，見表1。

3 討論

VDR基因定位于12號(hào)染色體長臂，其包含有11個(gè)外顯子，在基因組上總長為75 Kb，VDR包含427個(gè)氨基酸殘基，分子量為50 KD[4]。目前報(bào)導(dǎo)的VDR基因多態(tài)性與4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)有關(guān)，分別為2號(hào)外顯子的FokⅠ位點(diǎn)、第8內(nèi)含子的BsmⅠ位點(diǎn)、ApaⅠ位點(diǎn)及第9外顯子的TapⅠ位點(diǎn)。近年來，人們逐漸認(rèn)識(shí)到VDR的基因多態(tài)性除了參與調(diào)節(jié)鈣磷代謝外，其有著更廣泛的生理作用，如：抗增殖、抗分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)免疫反應(yīng)及多種內(nèi)分泌腺激素的分泌，調(diào)節(jié)造血組織造血等作用[5-6]。

研究證明，Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞這兩種細(xì)胞亞型參與了免疫介導(dǎo)性肝炎的發(fā)病機(jī)制。Treg細(xì)胞為體內(nèi)致免疫耐受的主要細(xì)胞，其有效控制病原體的T細(xì)胞反應(yīng)，而Th17細(xì)胞主要通過產(chǎn)生細(xì)胞因子，如IL-17可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，這兩種細(xì)胞亞型在特定的某些細(xì)胞因子等因素的作用下，可相互轉(zhuǎn)換，相互制約[7-9]。Sneha等[10]研究發(fā)現(xiàn)1，25-（OH）2D3可以通過阻礙IL-17轉(zhuǎn)錄因子活化T細(xì)胞核因子（NF-AT）復(fù)合體的形成，從而抑制IL-17的分泌，進(jìn)而減輕Th17細(xì)胞介導(dǎo)的促炎癥反應(yīng)。另有研究表明，1，25-（OH）2D3及其類似物通過作用于樹突狀細(xì)胞的nVDR，抑制了樹突狀細(xì)胞的成熟，使其處于未成熟狀態(tài)，因此其不能激活初始T細(xì)胞，進(jìn)而使免疫反應(yīng)不能繼續(xù)[11-12]。目前認(rèn)為，不成熟樹突狀細(xì)胞可分泌TGF-b和/或IL-10來誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加Treg細(xì)胞的水平，提高了機(jī)體的免疫耐受性[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CHB重度組、中度組患者的f等位基因分布頻率高于對(duì)照組，提示等位基因f分布頻率的提高可能與CHB的炎癥再活動(dòng)存在一定的關(guān)系。有研究表明，VDR基因FokⅠ多態(tài)性的C-T替換（F等位基因-f等位基因），造成潛在的起始位點(diǎn)，f等位基因編碼的VDR增加了3個(gè)氨基酸，f等位基因的轉(zhuǎn)錄效率比F等位基因降低了1.7倍，故ff基因型的個(gè)體，其VDR表達(dá)量較低，可能導(dǎo)致使ff基因型結(jié)合1，25-（OH）2D3的能力降低，進(jìn)而使其介導(dǎo)的免疫耐受反應(yīng)減弱，從而使慢乙肝患者所受的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的傷害從一定程度上有所增強(qiáng)[15-16]。由此推測(cè)，等位基因f分布頻率的提高可能會(huì)促進(jìn)慢性乙型肝炎患者炎癥的再活動(dòng)。

VDR的基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎的病情發(fā)展程度有一定的關(guān)系，ff基因型的慢性乙型肝炎患者其炎癥再活動(dòng)的可能性更大，且它極可能是通過影響個(gè)體的免疫功能而致病，這為更進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，了解慢性乙型肝炎的免疫發(fā)病機(jī)制及慢性乙型肝炎的基因治療提供了有價(jià)值的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Liang Y F. Natural history of chronic hepatitis B vurus infection and long-term outcome under treatment[J]. Liver International， 2009， 29（1）： 100-107.

[2] Zittermann A， Gummert J F.Sun， vitamin D， and cardiovascular disease [J].J Photochem Photobiol， 2010， 101（10）：124-129.

[3] Gao L， Tao Y， Zhang L， et al. Vitamin D receptor genetic polymorphisms and tuberculosis： updated systematic review and meta analysis[J]. Int J Tuberc Lung D， 2010， 14（5）： 15-23.

[4]崔健， 陳虹， 黃秉仁.維生素D受體最新研究進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展， 2011， 42（2）： 95-99.

[5] Wu-Wong J R. Potential for vitamin D receptor agonists in the treatment of cardiovascular disease[J].Br J Pharmaco， 2009， 158（11）： 395-412.

[6] Sreeram V R， Andreas H. A CHIP-seq defined genome-wide map of vitamin D receptor binding： Associations with disease and evolution[J].Nature Reviews Genetics， 2010， 11（6）： 670.

[7] Kimura A， Kishimoto T.IL-6： Regulator of Treg /Th17 balance[J]. Eur J Immunol， 2010， 40（7）： 1830-1835.

[8] Chapoval S， Dasgupta P， Dorsey N J， et al.Regulation of the T helper cell type 2 （Th2）/T regulatory cell （Treg） balance by IL-4 and STAT6[J].J Leukoc Biol， 2010， 87（6）： 1011-1018.

[9] Shi Y H， Shi G C， Wan H Y， et al.Coexistence of Th1/Th2 and Th17 /Treg imbalances in patients with allergic asthma[J]. Chin Med J（Engl）， 2011， 124（13）： 1951-1956.

[10] Sneha J， Luiz-Carlos P， Liu X K， et al. 1，25-dihydroxyvitamin D（3） ameliorates Th17 autoimmunity via transcriptional modulation of interleukin-17A.[J]Mol Cell Biol， 2011， 31（17）： 3653-3669.

[11] Holick M F. Evolution and function of vitamin D[J].Recent Results Cancer Res， 2003， 164（12）： 3-28.

[12] Matilainen J M， Malinen M， Turunen M M， et al. The number of vitamin D receptor binding sites defines the different vitamin D responsiveness of the CYP24 gene in malignant and normal mammary cells[J]. Biol Chem， 2010， 285（10）： 24 174-24 183.

[13] Ghiringhelli F， Puig P E， Roux S， et al. Tumor cellsconvert immature myeloid dendritic cells into TGF-betasecretingcells inducing CD4+CD25+ regulatory T cell proliferation[J].J Exp Med， 2005， 202（7）： 919-929.

[14] Huang B， Pan P Y， LI Q， et al. Gr-1+CD115+ immaturemyeloid suppressor cells mediate the development of tumorinduced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host[J]. Cancer Res， 2006， 66（2）： 1123-1131.

[15] Arai H， Miyamoto K， Taketani Y， et al. A vitamin D receptor genepolymorphism in the translation initiation codeon： Effect on protein activity and relation to bone mineral density in Japaneses women[J]. J Bone Miner Res， 1997， 12（6）： 915-921.

[16]韓世發(fā).阿德福韋酯聯(lián)合復(fù)方蟲草散劑治療慢性乙型肝炎的臨床觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48（21）：113-115.

（收稿日期：2014-01-26） （本文編輯：黃新珍）

[10] Sneha J， Luiz-Carlos P， Liu X K， et al. 1，25-dihydroxyvitamin D（3） ameliorates Th17 autoimmunity via transcriptional modulation of interleukin-17A.[J]Mol Cell Biol， 2011， 31（17）： 3653-3669.

[11] Holick M F. Evolution and function of vitamin D[J].Recent Results Cancer Res， 2003， 164（12）： 3-28.

[12] Matilainen J M， Malinen M， Turunen M M， et al. The number of vitamin D receptor binding sites defines the different vitamin D responsiveness of the CYP24 gene in malignant and normal mammary cells[J]. Biol Chem， 2010， 285（10）： 24 174-24 183.

[13] Ghiringhelli F， Puig P E， Roux S， et al. Tumor cellsconvert immature myeloid dendritic cells into TGF-betasecretingcells inducing CD4+CD25+ regulatory T cell proliferation[J].J Exp Med， 2005， 202（7）： 919-929.

[14] Huang B， Pan P Y， LI Q， et al. Gr-1+CD115+ immaturemyeloid suppressor cells mediate the development of tumorinduced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host[J]. Cancer Res， 2006， 66（2）： 1123-1131.

[15] Arai H， Miyamoto K， Taketani Y， et al. A vitamin D receptor genepolymorphism in the translation initiation codeon： Effect on protein activity and relation to bone mineral density in Japaneses women[J]. J Bone Miner Res， 1997， 12（6）： 915-921.

[16]韓世發(fā).阿德福韋酯聯(lián)合復(fù)方蟲草散劑治療慢性乙型肝炎的臨床觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48（21）：113-115.

（收稿日期：2014-01-26） （本文編輯：黃新珍）

[10] Sneha J， Luiz-Carlos P， Liu X K， et al. 1，25-dihydroxyvitamin D（3） ameliorates Th17 autoimmunity via transcriptional modulation of interleukin-17A.[J]Mol Cell Biol， 2011， 31（17）： 3653-3669.

[11] Holick M F. Evolution and function of vitamin D[J].Recent Results Cancer Res， 2003， 164（12）： 3-28.

[12] Matilainen J M， Malinen M， Turunen M M， et al. The number of vitamin D receptor binding sites defines the different vitamin D responsiveness of the CYP24 gene in malignant and normal mammary cells[J]. Biol Chem， 2010， 285（10）： 24 174-24 183.

[13] Ghiringhelli F， Puig P E， Roux S， et al. Tumor cellsconvert immature myeloid dendritic cells into TGF-betasecretingcells inducing CD4+CD25+ regulatory T cell proliferation[J].J Exp Med， 2005， 202（7）： 919-929.

[14] Huang B， Pan P Y， LI Q， et al. Gr-1+CD115+ immaturemyeloid suppressor cells mediate the development of tumorinduced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host[J]. Cancer Res， 2006， 66（2）： 1123-1131.

[15] Arai H， Miyamoto K， Taketani Y， et al. A vitamin D receptor genepolymorphism in the translation initiation codeon： Effect on protein activity and relation to bone mineral density in Japaneses women[J]. J Bone Miner Res， 1997， 12（6）： 915-921.

[16]韓世發(fā).阿德福韋酯聯(lián)合復(fù)方蟲草散劑治療慢性乙型肝炎的臨床觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48（21）：113-115.

（收稿日期：2014-01-26） （本文編輯：黃新珍）