聯(lián)合碳化公司UCARSAN 4256消毒劑抗禽喉氣管炎病毒及雞馬立克氏病毒效果測試

摘 要：本研究參照美國國家環(huán)境保護局（EPA）關于消毒劑在干燥的非生物體表面的抗病毒效果測評方法，評定聯(lián)合碳化公司UCAESAN 4256消毒劑對禽喉氣管炎病毒及雞馬立克氏病毒的殺毒效力。

關鍵詞：禽喉氣管炎病毒；馬立克氏病毒；抗病毒效果；評測；UCARSAN 4256消毒劑

1 實驗目的

本實驗旨在測評聯(lián)合碳化公司UCARSAN 4256消毒劑的抗禽喉氣管炎病毒和雞馬立克病毒的效力。其方法是用稀釋的消毒劑產(chǎn)品液對有病毒附著的污染物體硬表面消毒。本實驗模擬使用并遵照美國國家環(huán)境保護局（EPA）指南，按照EPA實驗室工作規(guī)范（美國聯(lián)邦法規(guī)匯編第40章第160節(jié)）進行操作。

2 實驗材料和方法

2.1 病毒

禽喉氣管炎病毒來自位于美國斯托斯巴克斯特路67號的斯帕法斯公司（SPAFAS）。

馬立克氏病毒（ATCC VR-2175）來自美國標準菌種庫。

2.2病毒培養(yǎng)細胞系

雞胚腎（Chicken Embryo Kidney，CEK）細胞系。

次代雞胚成纖維細胞（Secondary chicken Embryo Fibroblasts，CEF）。

2.3 活性成分

測試產(chǎn)品中的活性成分為戊二醛。

2.4 中和劑

試驗用中和劑：加熱滅活的胎牛血清。

2.5 接觸時間

病毒與測試產(chǎn)品的接觸時間5 min。

2.6 接觸溫度

接觸溫度20 ℃±2 ℃。

2.7 測試用試劑

磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）。

Eagle極限必需培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)基。

基本Eagle培養(yǎng)基添加5 %胎牛血清（次代雞胚成纖維細胞生長培養(yǎng)基）。

基本Eagle培養(yǎng)基添加8 %胎牛血清（雞胚腎細胞生長培養(yǎng)基）。

基本Eagle培養(yǎng)基添加2.5 %胎牛血清（次代雞胚成纖維細胞和雞胚腎維持培養(yǎng)基）。

1 200 mg/kg AOAC合成硬水。

2.8 測試條件

取2份測試消毒劑UCARSAN 4256消毒劑，用其滅活在玻璃培養(yǎng)皿表面已干燥的攻毒用病毒。在接觸一定時間后，從培養(yǎng)皿表面刮取消毒劑-病毒混合液，收集、中和和培養(yǎng)，以確定活病毒。

2.9 實驗材料

2.9.1攻毒病毒、宿主細胞系和培養(yǎng)基

2.9.2 補充培養(yǎng)基和試劑

a.磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）。

b.中和劑（加熱滅活的胎牛血清）。

2.9.3 實驗室設備和配備

3 實驗設計

3.1 病毒

試驗所用病毒母液購自位于美國馬里蘭州羅克維爾的美國標準菌庫（American Type Culture Collection，ATCC）或美國斯托斯巴克斯特路67號的斯帕法斯公司（SPAFAS），在美國MicrobioTest公司培育。病毒培養(yǎng)基在滴定和冷凍后用液氮貯藏。

3.2 載體制備

皮氏玻璃培養(yǎng)皿置于180 ℃下干熱滅菌2 h，隨后在室溫下冷卻、貯藏備用。

3.3 測試材料制備

測試消毒劑按照UCARSAN 4256消毒劑標簽說明進行制備。

3.4 測試

含有5 %有機土的冷凍病毒接種物在測試當天解凍（也可使用新鮮培養(yǎng)基）。每份接種物各取其中一小份噴灑在3個3×2平方英寸的無菌皮氏培養(yǎng)皿表面（60-mm），隨后在室溫下放置20～40 min以使其干燥。干燥后的接種物按照試驗發(fā)起人提出的要求或標簽說明加入消毒劑。培養(yǎng)板置于（20±1）℃環(huán)境中，放置時間由試驗發(fā)起人確定。每份培養(yǎng)板進行相同處理。

接觸5 min后，接種物/消毒劑混合的用細胞刮棒從培養(yǎng)皿的表面刮下，集中后進行中和。

收集洗出液，用合適的細胞培養(yǎng)物稀釋培養(yǎng)基進行10倍的倍比稀釋。

3.5 細胞培養(yǎng)

特選的稀釋液加入單層宿主細胞的培養(yǎng)基中（每份稀釋液設4個孔），隨后在（37±2） ℃和CO2含量 （5±1） %的環(huán)境下培養(yǎng)至病毒吸收（病毒懸垂）為止。

病毒吸收后，去掉該稀釋液。該單層細胞用磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）沖脫，隨后用細胞培養(yǎng)維持液再次培養(yǎng)。該培養(yǎng)基按照上述方式孵育，并在特定時間內(nèi)觀察病毒特異性細胞病變效應（Cytopathogenic Effect，CPE）。不會產(chǎn)生CPE的病毒將用使用人“O”型血、雞和/或豚鼠紅細胞的標準血細胞吸附/紅血球凝聚分析法進行評估，記錄觀察結果。

3.6 實驗對照組

3.6.1 每種病毒將在測試的時間內(nèi)進行滴定，以確定病毒傳染性。

3.6.2中和劑效力對照滴定將利用測試化合物-中和劑-病毒混合液進行。滴定結果將與PBS-病毒的對照混合液滴定結果進行對比。這將證明該中和反應方法的效力。此步驟可在測試前進行。

3.6.3 細胞毒性對照滴定將利用測試材料-中和劑混合液進行，以檢測添加宿主單層細胞的檢測材料的細胞毒性。此步驟可在測試前進行。

3.6.4 用無菌玻璃棒把病毒接種物涂在滅菌的皮氏玻璃培養(yǎng)皿表面，在室溫下放置30～60 min，使其自然干燥。干燥后加入2 mL PBS。該培養(yǎng)板采用與測試培養(yǎng)板相同的條件進行孵育。該混合物從培養(yǎng)皿的表面刮下按早先介紹的方法進行中和和滴定。此對照將證實在干燥后該病毒的感染性和可恢復的滴度（PBS培養(yǎng)板分離對照）。

3.7 計算方法

每一個測試組和對照組的平均CCID50/ mL值將通過Reed-Muench法，利用稀釋培養(yǎng)板進行測定。

4 產(chǎn)品評估標準

根據(jù)環(huán)境保護局（EPA）的規(guī)定，如果所有稀釋液中的病毒完全滅活得到證明，該檢測化合物將通過檢測。如果細胞毒性明顯存在，病毒滴度下降3log10后必須被證實低于細胞毒性水平。

5 實驗結果（見表4、5）

6 結論

聯(lián)合碳化公司UCARSAN 4256消毒劑在測試條件下，能有效殺滅禽喉氣管炎病毒和抗馬立克氏病毒?！酢?/p>