環(huán)境對轉基因小鼠抑郁樣行為的影響☆

陳靜 李晗△※ 張晨 王祖承 崔東紅△※

環(huán)境對轉基因小鼠抑郁樣行為的影響☆

陳靜*李晗*△※張晨*王祖承*崔東紅*△※

目的 探討環(huán)境因素對精神分裂癥斷裂基因1（disruptedinschizophrenia1，DISC1）轉基因小鼠抑郁樣行為的影響。方法C57BL/6野生型新生小鼠及C57BL/6 LBD-DISC1轉基因新生小鼠各16只，分別隨機分為野生實驗組、野生對照組和DISC1實驗組、DISC1對照組，每組8只。實驗組小鼠在哺乳期進行6 d母嬰分離，成年早期給予21 d慢性不可預知輕度應激，采用糖水消耗實驗及強迫游泳實驗測定四組小鼠行為，并比較各組小鼠的體質量改變。結果應激和DISC1缺陷對小鼠糖水偏好度沒有交互作用（P＞0.05），DISC1實驗組糖水偏好度低于其余三組（均P＜0.01）；應激和DISC1缺陷對小鼠強迫游泳實驗的靜止時間有交互作用（P=0.010），DISC1實驗組小鼠強迫游泳的靜止時間長于野生對照組和DISC1對照組（均P＜0.01）；應激和DISC1缺陷對體質量改變亦沒有交互作用（P＞0.05），但DISC1實驗組低于其余三組（均P＜0.01）。結論應激和DISC1缺陷共同作用導致小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。

母嬰分離 慢性不可預知輕度應激 糖水消耗實驗 強迫游泳實驗 抑郁癥

【Key words】Maternal separation Chronic unpredictablemild stress The sucrose consumption The forced swim test Depression

目前已經(jīng)建立的抑郁癥動物模型有藥理學模型、基因操作模型、行為學模型、環(huán)境應激模型等，這些均為單一因素建模。而近年來有研究者提出基因、環(huán)境雙重因素假設[1-2]，認為采用遺傳與環(huán)境應激相結合的方式建立抑郁癥動物模型能更好地模擬抑郁癥的自然發(fā)病機制。精神分裂癥斷裂基因1（disruptedinschizophrenia1，DISC1）是近年發(fā)現(xiàn)的抑郁癥易感基因之一[3]。本研究基于以上理論基礎，以DISC1轉基因小鼠為載體，采用母嬰分離復合慢性不可預知輕度應激方式，研究環(huán)境因素對DISC1轉基因小鼠抑郁樣行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物采用雄性C57BL/6野生型新生小鼠及C57BL/6 DISC1配體結合區(qū)域轉基因（C57BL/6 LBD-DISC1轉基因）新生小鼠各16只，分別隨機分為野生實驗組、野生對照組及DISC1實驗組、DISC1對照組，每組8只。C57BL/6野生型小鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。C57BL/6 LBD-DISC1轉基因小鼠由李衛(wèi)東實驗室贈送，該轉基因小鼠為國際同行認可的基因工程小鼠模型之一，其轉基因系統(tǒng)可誘導。在沒有誘導劑（他莫昔芬Tamxiofen）時，DISC1轉基因融合蛋白雖可表達，但被熱休克蛋白包裹，而進入蛋白降解過程；當注射誘導劑時，短片段DISC1轉基因融合蛋白被解放，從而與野生型DISC1競爭目的蛋白的結合位點，破壞DISC1正常功能[4]。本研究在小鼠出生后第7天注射誘導劑他莫昔芬（Sigma，美國）制備LBD-DISC1轉基因小鼠。本實驗方案獲得上海市精神衛(wèi)生中心倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型構建 將母鼠與新生小鼠置于室溫22±3℃（熱、冷應激除外）、相對濕度55%～60%、12 h/12 h光/暗（燈亮時間為早5時至晚5時，通宵照明應激除外）環(huán)境中飼養(yǎng)，允許自由進食、進水（禁食禁水應激除外）。出生后7～12 d，對野生實驗組及DISC1實驗組進行為期6 d的母嬰分離，3 h/d。出生后70～90 d期間，對野生實驗組及DISC1實驗組進行為期21 d的慢性不可預知輕度應激刺激，包括通宵照明（實驗室光源連續(xù)24 h開啟）、傾斜鼠籠（持續(xù)16 h將鼠籠傾斜45°）、夾尾（持續(xù)1 min）、搖晃（將小鼠放在240 r/min的搖床上5 min）、禁食禁水（持續(xù)24 h）、冰水游泳（將小鼠放置在4℃冰水中游泳5min）、潮濕墊料（墊料中傾倒150mL水，16 h后換墊料）。以上8種措施隨機采用，使小鼠無法預測。野生對照組和DISC1對照組只進行常規(guī)更換食水、墊料操作。

1.2.2 糖水消耗實驗 小鼠出生后91 d即成年后進行糖水消耗實驗。在經(jīng)過23 h的禁食禁水后，給予每只小鼠事先定量好的1瓶1%蔗糖水和1瓶純水。60min后，取瓶并稱質量。計算總液體消耗量、糖水偏好度（糖水偏好度=糖水消耗量/總液體消耗量×100%）。糖水偏好度是對獎勵的反應，對應抑郁癥的快感缺乏癥狀。

1.2.3 強迫游泳 小鼠出生后95 d即成年后進行強迫游泳實驗。將小鼠放入水深30 cm的圓柱形透明容器中使之游泳，起初小鼠掙扎試圖逃脫，很快變?yōu)椴粍訝顟B(tài)。實驗分為2天進行，第1天單只小鼠放入水中15 min，取出后在32℃溫室烘干，歸籠。24 h后再次實驗，記錄放入水中5min內(nèi)的累計不動狀態(tài)時間為靜止時間。強迫游泳中靜止時間反映小鼠的抑郁情緒。

1.2.4 體質量 在小鼠出生后60 d及91 d時，測量每只小鼠的體質量，并計算體質量改變。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析。糖水偏好指標、強迫游泳中靜止時間，以及體質量變化中應激和DISC1基因缺陷的作用采用兩因素方差分析法進行分析，采用LSD法進行兩兩比較。檢驗水準α為0.05。

2 結果

2.1 小鼠糖水偏好度應激（F=68.33，P＜0.01）與DISC1基因缺陷（F=43.30，P＜0.01）對小鼠糖水偏好度的主效應均有統(tǒng)計學意義，但是兩者沒有交互作用（F=1.47，P=0.24）。對各組數(shù)據(jù)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，野生對照組小鼠的糖水偏好度高于其余三組（P＜0.01），野生實驗組與DISC1對照組小鼠的糖水偏好度無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），DISC1實驗組小鼠的糖水偏好度低于野生實驗組和DISC1對照組（P＜0.01）。慢性應激（F=0.27，P=0.61）、DISC1基因（F=0.10，P=0.75）對小鼠總液體消耗量的主效應均無統(tǒng)計學意義，且兩者無交互作用（F= 0.33，P=0.57）。見表1。

2.2 小鼠強迫游泳中靜止時間應激對小鼠強迫游泳實驗中靜止時間的主效應有統(tǒng)計學意義（F= 171.87，P＜0.01），DISC1基因缺陷的主效應沒有統(tǒng)計學意義（F=1.36，P=0.26），但是兩者之間有交互作用（F=8.57，P=0.01）。對各組數(shù)據(jù)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與野生對照組相比，野生實驗組和DISC1實驗組小鼠的靜止時間較長（P＜0.01），DISC1對照組小鼠的靜止時間較短（P＜0.05）；DISC1實驗組小鼠的靜止時間長于DISC1對照組（P＜0.01），但是與野生實驗組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表1 小鼠糖水消耗實驗與強迫游泳實驗結果（±s）

表1 小鼠糖水消耗實驗與強迫游泳實驗結果（±s）

1）與野生對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.01；2）與DISC1實驗組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.01；3）與DISC1對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.01

強迫游泳靜止時間（s）167.80±5.721)141.20±8.473)172.40±2.191)3)130.50±3.87組別野生實驗組野生對照組DISC1實驗組DISC1對照組n8 8 8 8糖水偏好度0.47±0.131)2)0.78±0.093)0.13±0.071)3)0.55±0.04總液體消耗量（mL）3.32±0.86 3.35±0.93 3.45±1.20 2.87±1.64

表2 小鼠體質量測量結果（±s）

表2 小鼠體質量測量結果（±s）

1）與野生對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.01；2）與DISC1實驗組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.01；3）與DISC1對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.01

組別野生實驗組野生對照組DISC1實驗組DISC1對照組n8 8 8 8出生后60 d（g）18.74±0.5020.76±0.7919.40±0.4920.44±0.62出生后91 d（g）22.14±0.8426.72±1.1320.44±0.5223.95±0.31體質量改變（g）3.40±0.741)2)5.96±1.723)1.04±0.801)3)3.68±0.59

2.3 小鼠體質量變化應激（F=27.20，P＜0.01）與DISC1基因缺陷（F=21.743，P＜0.01）對小鼠體質量改變的主效應均有統(tǒng)計學意義，但是兩者沒有交互作用（F=0.01，P=0.94）。對各組數(shù)據(jù)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，野生對照組小鼠的體質量改變高于其余三組（P＜0.01），DISC1實驗組小鼠的體質量改變低于其余三組（P＜0.01）。見表2。

3 討論

目前認為抑郁癥是基因與環(huán)境相互作用導致的。DISC1基因是新近提出的抑郁癥易感基因之一[3]，多項研究顯示DISC1基因與抑郁癥相關[5]?；蜿P聯(lián)研究報道，DISC1基因SNP（Ser704Cys）的Cys704等位基因增高抑郁癥發(fā)病的危險度[6]。基于人群的研究顯示，DISC1變異與復發(fā)性抑郁癥的發(fā)病年齡等相關[7]。對DISC1基因突變小鼠的研究顯示，DISC1基因缺陷小鼠表現(xiàn)出社會快感缺乏等抑郁樣行為。本研究顯示出與之類似的結果，DISC1基因缺陷對小鼠糖水偏好度和體質量改變的主效應均有統(tǒng)計學意義，說明DISC1基因缺陷導致小鼠快感缺乏、體重較低。

在遺傳因素之外，抑郁癥也深受環(huán)境的影響，而應激是最重要的環(huán)境因素。動物實驗顯示，早年生活應激可通過下丘腦—垂體—腎上腺軸導致應激引起的神經(jīng)內(nèi)分泌反應增強以及成年后的抑郁[8-10]。在早年應激產(chǎn)生長期破壞性后果的基礎上，成年期生活事件導致抑郁癥的發(fā)病。相關動物實驗顯示，慢性應激影響嚙齒類動物的體重[11-12]；慢性不可預知應激使小鼠在鼠尾懸吊實驗中的靜止時間增加[13]，廣泛用于制作抑郁癥動物模型[14]；慢性社會應激導致社會回避、糖水消耗減少、強迫游泳的靜止時間增加等抑郁樣表現(xiàn)[15]。本研究對小鼠采用早年母嬰分離和成年期慢性不可預知輕度應激相結合的方式模擬人類患者在整個生命歷程中的應激模式，結果顯示，應激組小鼠糖水偏好度更低，強迫游泳實驗的靜止時間更長，體質量改變更少，表明應激可導致小鼠快感缺失、行為絕望、體重下降等抑郁樣表現(xiàn)。

以上結果表明，單一的DISC1缺陷或環(huán)境應激就可以顯現(xiàn)出一些抑郁樣行為改變。但是目前有關環(huán)境因素對基因缺陷小鼠抑郁樣行為的影響的相關研究還較少，而環(huán)境誘因作用于基因缺陷對象導致抑郁癥發(fā)生的這一模式，更符合人類精神疾病的自然發(fā)病過程。本研究采用DISC1缺陷作為基因因素，早年母嬰分離與成年早期慢性不可預知輕度應激相結合的復合慢性應激作為環(huán)境因素，結果發(fā)現(xiàn)，環(huán)境和DISC1基因缺陷對強迫游泳實驗的靜止時間有交互作用。這與已有的同類研究結果相一致[16]，如DISC1基因突變小鼠復合胎兒聚肌胞注射、朊蛋白啟動子調控的DISC1轉基因小鼠復合社會隔離的交互模型，均顯示出強迫游泳靜止時間延長的抑郁樣行為[17-18]。但是基因和應激對糖水偏好度和體重的影響都沒有協(xié)同作用，這可能與小鼠的活動度、行為測試實驗的設計等有關。已有的多項研究也提示，基因或環(huán)境因素對不同的行為實驗產(chǎn)生不同的影響，而其中的具體機制還需要繼續(xù)研究。

綜上所述，環(huán)境因素作用于基因缺陷小鼠導致抑郁發(fā)生，相比環(huán)境或基因單一因素導致抑郁，這能更好地模擬人類自然發(fā)病過程，為更準確地研究抑郁癥的發(fā)病機制和治療提供了基礎。本研究僅采用反映抑郁癥核心癥狀的行為學實驗作為評價指標，在進一步的研究中，還需納入更多的行為學、生理學、藥理學評價指標，從多方面驗證本模型的信效度。

[1] Nabeshima T,Kim HC.Involvement of genetic and environmental factors in the onset of depression[J].ExpNeurobiol,2013,22 (4):235-243.

[2] Niwa M,Kamiya A,Murai R,et al.Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits[J]. Neuron，2010,65(4):480-489.

[3] Bradshaw NJ,Porteous DJ.DISC1-binding proteins in neural development,signalling and schizophrenia[J].Neuropharmacology,2012,62(3):1230-1241.

[4] LiW,Zhou Y,Jentsch JD，et al.Specific developmental disruption of disrupted-in-schizophrenia-1 function results in schizophrenia-related phenotypes in mice[J].PNAS,2007,104(46): 18280-18285.

[5] Knight HM,Pickard BS,Maclean A,et al.A cytogenetic abnormality and rare coding variantsidentify ABCA13 as a candidate gene in schizophrenia,bipolar disorder and depression[J].Am J Hum Genet,2009,85(6):833-846.

[6] Hashimoto R,Numakawa T,Ohnishi T,et al.Impact of the DISC1 Ser704Cys polymorphism on risk for major depression, brain morphology and ERK signaling[J].Human Molecular Genetics,2006,15(20):3024-3033.

[7] PA Thomson,DJ MacIntyre,G Hamilton,et al.Association of DISC1 variantswith age of onset in a population-based sample of recurrent major depression[J].Mol Psychiatry,2013,18(7): 745-747.

[8] Enthoven L,Oitzl MS,Koning N,et al.Hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity of newborn mice rapidly desensitizes to repeated maternal absence but becomes highly responsive to novelty[J].Endocrinology,2008,149(12):6366-6377.

[9] Nishi M,Horii-Hayashi N,Sasagawa T,et al.Effects of early life stress on brain activity:implications from maternal separation model in rodents[J].Gen Comp Endocrinol,2013,15(181): 306-309.

[10] 潘楠楠,王敏,馮海燕,等.早期母愛剝奪促發(fā)抑郁并增加癲癇易感性[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2013,39(7):406-410.

[11] Lee JK.Anti-depressant like effect of methyl gallate isolated from acerbarbinervein mice[J].Korean J Physiol Pharmacol, 2013,17(5):441-446.

[12] Schweizer MC,Henniger MS,Sillaber I.Chronic mild stress (CMS)in mice:of anhedonia,'anomalous anxiolysis'and activity [J].P Lo S One,2009,4(1):e4326.

[13] Yoon SH,Kim BH,Ye SK,et al.Chronic non-social stress affects depressive behaviors but not anxiety in mice[J].Korean J Physiol Pharmacol,2014,18(3):263-268.

[14] Hill MN,Hellemans KG,Verma P.Neurobiology of chronic mild stress:parallels tomajor depression[J].Neurosci Biobehav Rev,2012,36(9):2085-2117.

[15] Venzala E,García-García AL,ElizaldeN,et al.Chronic social defeat stress model:behavioral features,antidepressant action, and interaction with biological risk factors[J].Psychopharmacology(Berl),2012,224(2):313-325.

[16] Ibi D,Nagai T,Koike H,et al.Combined effect of neonatal immune activation and mutant DISC1 on phenotypic changes in adulthood[J].Behav Brain Res,2010,206(1):32-37.

[17] Abazyan B,Nomura J,Kannan G,et al.Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology[J].Biol Psychiatry,2010,68(12):1172-1181.

[18] Niwa M,Jaaro-Peled H,Tankou S,et al.Adolescent stress-induced epigenetic control of dopaminergic neurons via glucocorticoids[J].Science,2013,339(6117):335-339.

The influence of environment on depressive-like behavior of transgenic mice.

CHEN Jing,LI Han,ZHANG Chen,WANG Zucheng,CUI Donghong.
Shanghai Mental Health Center,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200030,China.Tel:021-64387250.

ObjectiveTo investigate the influence of environment on despressive-like behavior in DISC1 transgenic mice.MethodsSixteen C57BL/6 wild-typemice were random ly assigned into two groups,the WT-stress group and theWT-control group.Sixteen C57BL/6 LBD-DISC1 transgenicmicewere also randomly assigned into 2 groups,the DISC1-stress group and the DISC1-control group.TheWT-stress group and the DISC1-stress group received daily 3 h maternal separation for six consecutive days and chronic unpredictablemild stress for 21 consecutive days.The sucrose consumption and the forced swim testwere used to evaluate depressive-like behaviors.The changes of bodyweightwere measured.ResultsTherewas no interaction(P＞0.05)between environment and gene associated with the preference for sucrose solution.However,the preference for sucrose solution was lower in the DISC1-stress group than in the rest 3 groups(P＜0.01).Interaction between environment and gene associated with the immobility time was significant(P= 0.010)in the forced swim test.The immobility time was longer in the DISC1-stress group than in theWT-control group (P＜0.01).The bodyweightwas lower in the DISC1-stress group than in the rest3 groups(P＜0.01).But the interaction of environmentand gene associated with bodyweightwas not significant(P＞0.05).ConclusionThe interaction of gene and environment can induce depressive-like behavior inmice.

R749.4

A

2014-08-25）

（責任編輯：肖雅妮）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.09.008

☆上海市科技發(fā)展基金實驗動物研究項目（編號：12140904200）；國家自然科學基金（編號：81171266；81271481）；上海市重性精神病重點實驗室（編號：13dz2260500）

*上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心（上海 200030）

△上海市重性精神病重點實驗室

※上海交通大學精神疾病轉化醫(yī)學研究重點實驗室