固相萃取-高效液相色譜法測定醬油專用焦糖中5-羥甲基糠醛和糠醛

黃曉雯，馮笑軍

（廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510075）

焦糖是一種在食品中應(yīng)用范圍十分廣泛的天然著色劑，其主要是用飴糖、蔗糖、葡萄糖等熬成的黏稠液體或粉末，深褐色，有苦味，主要用于醬油、糖果、醋、啤酒等的著色。其中醬油專用焦糖為耐鹽焦糖，相當(dāng)于國際III類焦糖。一般認(rèn)為，焦糖反應(yīng)有兩種類型：一類是在有胺伴隨下的美德拉反應(yīng)，另一類是在相當(dāng)高的溫度（大約200℃）發(fā)生的純焦糖化反應(yīng)（單純地加熱葡萄糖的焦化反應(yīng)）。這2種劇烈反應(yīng)均會生成5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）和糠醛（furfural）[1]。這2種物質(zhì)具備增香調(diào)色功能，參與生成多種香味物質(zhì)和深色物質(zhì)。5-HMF和糠醛若達(dá)到一定的劑量時可對人體產(chǎn)生危害。研究表明，一定劑量的糠醛或5-HMF 被機體吸收后，會對呼吸道、肝臟、腎臟、心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等器官產(chǎn)生不良影響；5-HMF還會造成動物橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害[2-3]。

目前，我國僅有GB/T 18932.18—2003《蜂蜜中羥甲基糠醛含量的測定方法液相色譜一紫外檢測法》[4]有關(guān)于5-HMF的檢測方法，還沒有關(guān)于廣泛食品中的5-HMF和糠醛的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。國內(nèi)研究文獻多數(shù)使用液相色譜法[2-10]檢測，少量報道使用氣相色譜（gas chromatogram，GC）[11]、氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS）[12]和液質(zhì)聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC/MS）[13-15]進行檢測。在食品領(lǐng)域的檢測對象主要集中在蜂產(chǎn)品[4，7]、酒類[3，5，8]等。提取的手段主要使用有機溶劑進行提取[2-4，8，12]。未見有關(guān)于焦糖中5-HMF和糠醛檢測的研究報道。

本研究旨在建立醬油專用焦糖中5-羥甲基糠醛和糠醛含量的分析方法，用于分析2種物質(zhì)在焦糖中的含量情況，為分析焦糖添加到醬油后5-羥甲基糠醛和糠醛含量變化以及2種物質(zhì)對增香物質(zhì)的產(chǎn)生作用提供數(shù)據(jù)參考。該方法采用親水親脂平衡的水可浸潤性反相吸附劑固相萃取柱對基質(zhì)復(fù)雜的焦糖樣品進行萃取凈化，能有效清除焦糖中的極性雜質(zhì)干擾。結(jié)合優(yōu)化的液相色譜分離條件，5-羥甲基糠醛和糠醛獲得良好的分離效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油專用焦糖：市售；糠醛標(biāo)準(zhǔn)品（99%）、5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品（99.5%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：美國TEDIA公司；OASIS WAX固相萃取柱：美國Waters 公司；本實驗所用的水為超純水。

固相萃取柱：Oasis HLB，500mg，6mL，使用時依次加入3mL水、3mL甲醇和3mL水活化。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance2695/2487高效液相色譜儀配紫外可見光檢測器：美國Waters公司；Bs210s天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；MS3渦旋振蕩儀：廣州科儀實驗室技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：準(zhǔn)確稱取5-羥甲基糠醛和糠醛各25.00mg，用3mL甲醇溶解，用純水定容至25mL。所得溶液質(zhì)量濃度均為1mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)工作液使用純水稀釋成適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：SymmetryShield RP18（250mm×4.6mm）；柱溫：30℃；流動相為A：水，B：乙腈；洗脫方式：梯度；流速：1mL/min；進樣量：10μL；檢測波長：280nm。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度Table 1 Gradient table of the mobile phase

1.3.3 樣品處理

稱取焦糖樣品0.200g，用水稀釋定容至10mL。準(zhǔn)確吸取5mL稀釋液至活化好的親水親油平衡（hydrophilelipophile balance，HLB）柱上，用6mL水清洗，抽真空直到柱子里面的水被抽干，加入5mL甲醇進行洗脫，補加甲醇定容至5mL。靜置1h后準(zhǔn)確吸取上清液和純水各1mL，渦旋30s，過0.45μm濾膜，上機待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取條件的選擇和優(yōu)化

2.1.1 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱是利用固體吸附劑將樣品中的目標(biāo)化合物吸附，利用不同物質(zhì)的極性差異使目標(biāo)化合物與基體干擾物分離，再用洗脫液淋洗達(dá)到分離和富集的目的。根據(jù)5-羥甲基糠醛和糠醛的結(jié)構(gòu)特點，比較了OASIS HLB 固相萃取柱、C18固相萃取柱和聚合物陽離子交換（polymer cation exchange，PCX）固相萃取柱等的凈化效果。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普通C18固相萃取柱由于中間步驟有抽干水的原因，因此對目標(biāo)物的保留和洗脫效果均不理想；而HLB和PCX柱有聚合物吸附劑，可以抵抗干涸帶來的吸附能力的影響。在對HLB柱和PCX柱進行一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液試驗結(jié)果表明，使用HLB柱進行凈化，5-羥甲基糠醛和糠醛均有90%以上的回收率（見圖1）；而PCX柱2種目標(biāo)物質(zhì)均只有80%左右的回收率。因此，選擇HLB柱作為本方法固相萃取使用柱。

圖1 5-HMF和糠醛在HLB柱上的回收率曲線圖Fig.1 Recovery curve of 5-HMF and furfural in HLB cartridge

2.1.2 固相萃取柱凈化條件優(yōu)化

針對固相萃取中的清洗步驟，實驗使用純水、5%和10%體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液分別進行清洗，測試清洗液中5-羥甲基糠醛和糠醛的含量。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5%和10%體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液都會不同程度洗脫出5-羥甲基糠醛，而純水沒有。因此選擇純水作為清洗溶液。針對固相萃取洗脫步驟，分別選用丙酮、乙腈、甲醇作洗脫溶劑。實驗發(fā)現(xiàn)，3種溶劑都能將5-羥甲基糠醛洗脫下來，但對糠醛的洗脫能力有區(qū)別：丙酮＜乙腈＜甲醇。同時，使用甲醇做洗脫劑能使樣品雜質(zhì)沉淀較多而不影響5-羥甲基糠醛和糠醛在洗脫液中的含量，因此選擇甲醇作為洗脫劑。

優(yōu)化后所得固相萃取純化條件為使用OASIS HLB柱，上樣體積為5mL、10mL 純水洗雜質(zhì)、5mL甲醇洗脫。圖2和圖3分別為焦糖樣品使用HLB柱凈化前和后的效果圖。從圖2可知，HLB固相萃取柱能較好地清除樣品中的雜質(zhì)，并減少對5-羥甲基糠醛和糠醛的干擾。

2.2 流動相的選擇

以水+乙腈、水+甲醇2種流動相體系、采用梯度洗脫和等度洗脫4種條件來對流動相條件進行優(yōu)化。通過優(yōu)化實驗表明，使用水+乙腈，采用梯度洗脫能使2種物質(zhì)獲得良好的峰形，結(jié)果見圖4。而且利用梯度洗脫讓強極性雜質(zhì)先洗脫出來，減少基質(zhì)干擾影響，從而能獲得良好的分離度。

2.3 檢測波長的確定

在200～300nm范圍內(nèi)對5-羥甲基糠醛和糠醛進行紫外光譜掃描，5-羥甲基糠醛在波長275nm處有最大吸收；糠醛在波長284nm處有最大吸收。為了能同時檢測5-羥甲基糠醛和糠醛并讓2種物質(zhì)同時獲得較好的響應(yīng)值，取280nm作為2種物質(zhì)的檢測波長。

圖2 焦糖樣品未使用HLB柱凈化前的色譜圖Fig.2 Chromatogram of caramel sample not purified by HLB cartridge

圖3 焦糖樣品使用HLB柱凈化后的色譜圖Fig.3 Chromatogram of caramel sample purified by HLB cartridge

圖4 5-羥甲基糠醛和糠醛的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.4 Chromatogram of furfural and 5-HMF standard solution

2.4 方法的線性范圍和檢出限

用5-羥甲基糠醛和糠醛混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液100μg/mL分別配制質(zhì)量濃度為0.5μg/mL、1.0μg/mL、10.0μg/mL、30.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，在本儀器條件下進行測定，線性方程、線性相關(guān)系數(shù)見表2。

從表2可知，2種物質(zhì)在0.5～100μg/mL范圍內(nèi)均獲得良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999。按信噪比S/N=3計算5-羥甲基糠醛和糠醛的儀器檢出限分別為0.39ng/mL和0.41ng/mL，然后按照本實驗方法操作，本方法的最低檢出限（limit of detection，LOD）為：5-羥甲基糠醛0.039mg/kg，糠醛0.041mg/kg。

表2 5-羥甲基糠醛和糠醛的線性方程、相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations,R2 of 5-HMF and furfural

2.5 精密度和回收率

平行稱取18份相同醬油專用焦糖的樣品，并向樣品添加一定量的5-羥甲基糠醛和糠醛混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實驗方法處理測定，使用外標(biāo)法定量，并計算回收率，結(jié)果見表3。5-羥甲基糠醛和糠醛的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在2.5%～4.6%之間，加標(biāo)回收率在87.1%～99.2%之間，精密度和回收率均滿足方法學(xué)定量要求。

表3 精密度與加標(biāo)回收率試驗結(jié)果（n＝6）Table 3 Results of precision and recovery rate test

2.6 實際樣品的測定

使用本方法對以不同的糖為原料，使用不同工藝方法制成的焦糖進行5-羥甲基糠醛和糠醛含量檢測，分析結(jié)果詳見表4。

表4 不同原料和加工方法的焦糖中5-羥甲基糠醛和糠醛含量Table 4 Content of 5-HMF and furfural in caramel obtained by different materials and processing methods

從表4可知，相同原料和工藝的不同焦糖中，5-羥甲基糠醛和糠醛的含量變化比較大；相同原料不同工藝的焦糖所含的5-羥甲基糠醛和糠醛含量相差也很大。以同一種糖為原料，使用方法2生產(chǎn)的焦糖相對使用方法1和方法3生產(chǎn)的焦糖中5-羥甲基糠醛和糠醛較低。從實驗結(jié)果看，不同的原料和加工方法會對焦糖中5-羥甲基糠醛和糠醛的生成有影響作用，其影響程度和生成機理以及對醬油的影響仍需進一步研究探討。

3 結(jié)論

采用親水親脂平衡的水可浸潤性反相吸附劑固相萃取柱OASIS HLB對醬油專用焦糖進行凈化，采用高效液相色譜法進行檢測，建立了定量測定醬油專用焦糖中5-羥甲基糠醛和糠醛的含量方法。本方法在0.5～100μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2＞0.999，RSD（n=6）在2.5%～4.6%之間，加標(biāo)回收率在87.1%～99.2%之間，5-羥甲基糠醛和糠醛的方法檢出限（LOD）分別為0.039mg/kg和0.041mg/kg。方法學(xué)試驗結(jié)果表明其具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、干擾雜質(zhì)少的特點，能滿足企業(yè)對原料進行檢測監(jiān)控的需要。為分析原料和加工方法對焦糖中5-羥甲基糠醛和糠醛含量的影響以及對添加到醬油后的影響和芳香物質(zhì)的變化的研究提供可靠的試驗方法和研究數(shù)據(jù)。

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