山西老陳醋中乙偶姻和川芎嗪的高效液相色譜法測(cè)定

楊宇霞，楊林娥，張 磊，韓建欣，彭曉光*

（山西省生物研究所，山西 太原 030006）

山西老陳醋是中國(guó)的四大名醋之一[1]，其不僅是人們生活必需的調(diào)味品，而且是一種保健養(yǎng)生食品，具有調(diào)節(jié)血糖血脂、降低血壓、抗癌等功效[2]。近年來(lái)，老陳醋的藥用保健作用越來(lái)越受到重視，其功能性成分也成為現(xiàn)代研究的熱點(diǎn)。川芎嗪學(xué)名四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP），是山西老陳醋的重要風(fēng)味物質(zhì)，也是山西老陳醋重要的功能成分之一，具有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善腦缺血等多種作用[3]。乙偶姻（acetoin，ACT）學(xué)名3-羥基丁酮，是一種令人愉快的香味物質(zhì)，為食品行業(yè)常用的香料品種，也是食醋中重要的風(fēng)味物質(zhì)。文獻(xiàn)報(bào)道，川芎嗪形成機(jī)制的一種假設(shè)是乙偶姻和氨氣反應(yīng)形成的產(chǎn)物[4]。因此，準(zhǔn)確測(cè)定山西老陳醋中乙偶姻和川芎嗪的含量對(duì)山西老陳醋保健功能的開發(fā)及川芎嗪生成機(jī)理的探索具有重要意義。

乙偶姻的檢測(cè)方法多用氣相色譜法或者氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[5-13]，其準(zhǔn)確性較差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，而液相色譜法報(bào)道較少[14]。余書奇等[15]建立了一種2，4-二硝基苯肼衍生-高效液相色譜測(cè)定葡萄酒中總乙偶姻的方法，但需要進(jìn)行衍生化實(shí)驗(yàn)，步驟繁瑣。張少飛等[16]建立了高效液相色譜法單獨(dú)測(cè)定山西老陳醋中的川芎嗪的方法。而乙偶姻和川芎嗪同時(shí)檢測(cè)的方法鮮有報(bào)道，只有陳繼承等[3]進(jìn)行了一些研究。本實(shí)驗(yàn)建立了山西老陳醋中乙偶姻和川芎嗪的液相色譜測(cè)定方法，并針對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，期望對(duì)山西老陳醋中乙偶姻和川芎嗪的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：東湖、水塔、紫林、寧化府4個(gè)品牌的市售產(chǎn)品和相關(guān)企業(yè)提供的山西老陳醋；乙偶姻、川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品：上海阿拉丁試劑有限公司；甲醇（色譜純）：安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司；乙酸（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取乙偶姻2.5g、川芎嗪25mg，用流動(dòng)相分別定容至50mL容量瓶中，配制成乙偶姻50mg/mL，川芎嗪500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。把乙偶姻、川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋不同倍數(shù)，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司，配有四元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器和化學(xué)工作站；KQ-500D超聲波清洗儀：東莞市科橋超聲波儀器有限公司；TG16-WS高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；NW150V超純水系統(tǒng)：上?？道追治鰞x器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

取4mL樣品，調(diào)pH值為7.2，用提取劑定容至25mL。超聲提取45min，10 000r/min離心5min，去除沉淀，取上清液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（2）（4.6mm×250mm，5μm）；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)279nm；流動(dòng)相：1%醋酸水溶液（加0.05%三氟乙酸）/甲醇=70∶30；流速0.8mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的確定

分別選擇Agilent TC-C18（2）、Agilent Zorbax SB-C18、Agilent Zorbax SB-Aq色譜柱進(jìn)行篩選試驗(yàn)，結(jié)果表明，Agilent TC-C18（2）色譜柱對(duì)乙偶姻和川芎嗪的保留時(shí)間和分離效果都較好，故最終選擇Agilent TC-C18（2）作為分析用色譜柱。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

用190～400nm紫外光對(duì)乙偶姻、川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，綜合考慮乙偶姻和川芎嗪的吸收強(qiáng)度，最終選擇二者都有較強(qiáng)吸收的279nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 提取劑的確定

分別用1%醋酸水溶液（加0.05%三氟乙酸）和5%醋酸水溶液與甲醇以20∶80的比例混合，配制成提取劑1和2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同提取劑對(duì)乙偶姻、川芎嗪的提取峰面積結(jié)果見表1。由表1可知，提取劑1的提取效果明顯優(yōu)于提取劑2，故確定1%醋酸水溶液（加0.05%三氟乙酸）/甲醇=20∶80為實(shí)驗(yàn)用提取劑。

表1 不同提取劑對(duì)乙偶姻和川芎嗪的提取效果Table 1 Extraction effect of ACT and TMP with different extraction solvents

2.4 提取劑比例的確定

分別配制甲醇體積分?jǐn)?shù)為0、30%、50%、80%、90%、100%的提取劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，乙偶姻、川芎嗪的峰面積增大。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到目的80%時(shí)，二者的提取效果最佳。甲醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，二者的峰面積開始減小，故最終確定1%醋酸水溶液（加0.05%三氟乙酸）/甲醇=20∶80為實(shí)驗(yàn)條件。

表2 不同甲醇比例對(duì)乙偶姻和川芎嗪的提取效果的影響Table 2 Effects of methanol proportion on extraction effect of ACT and TMP

2.5 pH值的確定

取同一樣品，調(diào)節(jié)不同的pH值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。不同pH值下，乙偶姻、川芎嗪的提取峰面積結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，隨著pH值的升高，二者的提取峰面積增大。當(dāng)pH值達(dá)到7.2時(shí)，提取效果最好。隨著pH值的繼續(xù)增加，乙偶姻和川芎嗪的提取峰面積開始減小，故最終選擇pH值7.2為實(shí)驗(yàn)條件。

表3 不同pH值對(duì)乙偶姻和川芎嗪提取效果的影響Table 3 Effects of pH on extraction effect of ACT and TMP

2.6 線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

將乙偶姻和川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋不同的倍數(shù)，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)使用液系列，進(jìn)樣分析。以乙偶姻和川芎嗪的峰面積（Y）對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算檢出限，結(jié)果見表4。乙偶姻、川芎嗪混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

表4 線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 4 Linear equation,correlation coefficient and detection limit

由表4可知，乙偶姻和川芎嗪在所測(cè)試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999 99，檢出限分別為7.335μg/mL、0.068μg/mL，高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定乙偶姻和川芎嗪線性范圍寬，檢測(cè)限低，具有較高的靈敏度。

圖1 乙偶姻、川芎嗪混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of the mixed standard solution of ACT and TMP

2.7 精密度

將同一老陳醋樣品，按1.3節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，對(duì)乙偶姻和川芎嗪的峰面積進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表5。

表5 方法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of precision experiments

由表5可知，乙偶姻和川芎嗪峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.67%和0.20%，表明方法精密度較好。

2.8 回收率

取同一老陳醋樣品，采用樣品加標(biāo)的方法計(jì)算回收率，結(jié)果見表5，老陳醋加標(biāo)色譜圖見圖2。從表6可以看出，乙偶姻、川芎嗪的加標(biāo)回收率在96.5%～104.1%之間，方法準(zhǔn)確性較高，適合于山西老陳醋中乙偶姻和川芎嗪的檢測(cè)分析。

表6 方法回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of recovery rate experiments

2.9 樣品的測(cè)定

按照上述方法，對(duì)幾種品牌山西老陳醋樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表7。

圖2 山西老陳醋加標(biāo)色譜圖Fig.2 Chromatogram of Shanxi aged vinegar spiked with ACT and TMP

表7 山西老陳醋樣品中乙偶姻和川芎嗪的含量Table 7 Content of ACT and TMP in Shanxi aged vinegar samples

由表7可知，山西老陳醋樣品中均含有不同質(zhì)量濃度的乙偶姻和川芎嗪，但不同品牌山西老陳醋樣品乙偶姻和川芎嗪的含量存在一定的差異，乙偶姻的質(zhì)量濃度分布范圍0.95～3.00mg/mL，川芎嗪的質(zhì)量濃度范圍在44.74～285.68μg/mL之間?？梢?，乙偶姻和川芎嗪是山西老陳醋中重要的風(fēng)味物質(zhì)，一定程度上可以反映山西老陳醋的保健功效。

3 結(jié)論

川芎嗪和乙偶姻都是山西老陳醋中重要的風(fēng)味物質(zhì)，采用酸性甲醇溶液提取，高效液相色譜法測(cè)定，乙偶姻、川芎嗪的回收率在96.5%～104.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤1.67%，方法前處理簡(jiǎn)單，精密度高、準(zhǔn)確性好，該方法可作為山西老陳醋中乙偶姻和川芎嗪含量測(cè)定的參考方法，為山西老陳醋的品質(zhì)控制和保健功能的開發(fā)提供依據(jù)。

[1]彭曉光，楊林娥，李 婷，等.山西老陳醋中總黃酮含量的測(cè)定[J].中國(guó)釀造，2012，31（8）：151-153.

[2]陳樹俊，蘇 靜，張海英，等.山西老陳醋功效成分的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·創(chuàng)新版，2009（12）：45-49.

[3]馮 斌，陳樹俊，姜 慧，等.山西老陳醋中川芎嗪生成趨勢(shì)分析[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·創(chuàng)新版，2011（9）：69-74.

[4]陳繼承，何 靜，吳 靖，等.食醋中川芎嗪快速檢測(cè)及其生成機(jī)理初探[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2013，13（5）：223-229.

[5]姜文廣，李記明，徐 巖，等.4 種釀酒紅葡萄果實(shí)的揮發(fā)性香氣成分分析[J].食品科學(xué)，2011，32（6）：225-229.

[6]陳 功，張其圣，余文華，等.四川泡菜揮發(fā)性成分及主體風(fēng)味物質(zhì)的研究（二）[J].中國(guó)釀造，2010，29（12）：19-23.

[7]徐禾禮，余小林，胡卓炎，等.七個(gè)荔枝品種果實(shí)香氣成分的提取與分析研究[J].食品與機(jī)械，2010，26（2）：23-26.

[8]練 敏，紀(jì)曉俊，胡 南，等.氣相色譜法快速測(cè)定產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物[J].分析試驗(yàn)室，2008，27（S1）：19-21.

[9]鄒青青，黃明泉，孫寶國(guó)，等.同時(shí)蒸餾萃取結(jié)合GC-MS 分析紅托竹蓀揮發(fā)性成分[J].食品工業(yè)科技，2011，32（10）：425-430.

[10]陳海濤，張 寧，劉 洋，等.ASE-SAFE 和SDE-GC-MS 分析賈永信臘牛肉的揮發(fā)性香氣成分[J].精細(xì)化工，2013，30（2）：166-173.

[11]喬海軍，楊繼濤，魏晉梅，等.云曉養(yǎng)生保健醋香味成分的GC-MS 分析[J].中國(guó)釀造，2009，28（9）：151-153.

[12]梁 琪，張衛(wèi)兵，張 炎，等.百合酸奶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分分析[J].食品工業(yè)科技，2012，33（16）：99-107.

[13]張松山，李海鵬，孫寶忠.發(fā)酵牛肉中香味活性化合物的分析[J].食品科學(xué)，2009，30（20）：316-319.

[14]ZEPPA G，CONTERNO L，GERBI V.Determination of organic acids，sugars，diacetyl，and acetoin in cheese by high-performance liquid chromatography[J].J Agr Food Chem，2001，49（6）：2722-2726.

[15]余書奇，晏日安，陳文銳，等.2，4-二硝基苯肼衍生/高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒中總乙偶姻的含量[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2013，32（2）：223-227.

[16]張少飛，李 婷，彭曉光，等.高效液相色譜法測(cè)定山西老陳醋中的川芎嗪[J].食品工程，2009（2）：43-45.