酵母抽提物鮮味（umami）及濃厚味（kokumi）滋味活性的評(píng)價(jià)與研究

劉建彬，宋煥祿

（北京工商大學(xué) 分子感官科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

作為天然食品，酵母抽提物（yeast extract，YE）廣泛應(yīng)用于食品的調(diào)香及調(diào)味[1]。YE是采用面包酵母、啤酒酵母等原料經(jīng)發(fā)酵、自溶、水解、濃縮等工藝制成的膏狀或粉狀產(chǎn)品[2]。YE富含氨基酸、核苷酸、多肽及B族維生素，這些化合物同時(shí)也是其典型風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。在現(xiàn)代食品工業(yè)中，YE具有兩大作用：一方面，作為風(fēng)味原料或氣味前驅(qū)物，應(yīng)用于食品氣味的增強(qiáng)尤其是肉味的增強(qiáng)中[4]；另一方面，其還常作為滋味促進(jìn)劑而被應(yīng)用于食品的提鮮中[5]。YE是一種極佳的風(fēng)味增強(qiáng)食品，具有很好的應(yīng)用前景。

鮮味（umami）是最近被人們認(rèn)可的一種基本味，其經(jīng)常被形容為谷氨酸及其鹽類的味道。自從1908年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，多種化合物如谷氨酸及其鈉鹽、天門冬氨酸及其鈉鹽、5’-核苷酸及其鈉鹽、琥珀酸及其鈉鹽等被鑒定出具有鮮味[6]。濃厚味（kokumi）這一概念是由日本科學(xué)家提出來(lái)的，被形容為滿口感和味覺(jué)復(fù)雜感[7]。作為一種滋味增強(qiáng)劑，有濃厚味效果的物質(zhì)本身通常沒(méi)有味道或者沒(méi)有其所表現(xiàn)的味道。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，多種小肽具有重要的濃厚味效果[8-10]。谷胱甘肽是第一種被明確鑒定出具有濃厚滋味效果的物質(zhì)[11]。在鮮味呈現(xiàn)機(jī)制的研究中，L-谷氨酸選擇G蛋白，代謝型谷氨酸受體4亞型（metabotropic glutamate receptor 4，mGluR4）和代謝型谷氨酸受體1亞型（metabotropic glutamate receptor 1，mGluR1），味蕾表達(dá)異質(zhì)二聚體T1R1+T1R3等受體對(duì)鮮味具有關(guān)鍵作用，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在有核苷酸、多肽等多種物質(zhì)存在時(shí)，多個(gè)味覺(jué)受體表現(xiàn)出復(fù)雜的協(xié)同關(guān)系[12]。而味蕾上的鈣離子受體（calcium-sensing receptor，CaSR）被明確報(bào)道為kokumi物質(zhì)的味覺(jué)受體，可以起到對(duì)咸味、甜味、鮮味多個(gè)滋味的提升作用[13]。

目前關(guān)于YE風(fēng)味的研究中，多集中在對(duì)其氣味活性化合物的探索[4，14-16]。滋味方面，F(xiàn)ESTRING D等[5]從酵母抽提物模型美拉德反應(yīng)體系中鑒定出鮮味提升N2-（1-羧乙基）-鳥(niǎo)苷-5’-單磷酸鹽。而其他尚無(wú)關(guān)于YE滋味活性的尤其是umami及kokumi的報(bào)道。

本研究采用切向流超濾（ultra-filtration，UF）、凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC），高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）等分離技術(shù)，對(duì)YE中的umami及kokumi活性組分如肽段、5’-核苷酸及谷胱甘肽進(jìn)行分離、定性及定量。應(yīng)用模型溶液構(gòu)建、描述性感官鑒評(píng)、時(shí)間-反饋鑒評(píng)、劑量-反饋鑒評(píng)技術(shù)對(duì)YE的umami和kokumi活性進(jìn)行描述和評(píng)價(jià)。為YE在滋味促進(jìn)方面的應(yīng)用提供支持和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

普通酵母抽提物（normal yeast extract，NYE）、高純酵母抽提物（high pure yeast extract，HPYE）、高肌苷酸（Inosine monophosphate，IMP）+鳥(niǎo)苷酸（guanosine monophosphate，GMP）酵母抽提物（HIGYE）：湖北安琪酵母有限公司；實(shí)驗(yàn)室用高純水：Millipore Simplicity 系統(tǒng)自制；KH2PO4、Tris-HCl緩沖液、磷酸緩沖液、甲醛、5，5’-二硫代二硝基苯甲酸（5，5’-dithiobisnitrobenzoicacid，DTNB）染液、蔗糖、乳酸、咖啡因、NaCl、谷氨酸鈉、肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸：國(guó)藥集團(tuán)試劑公司；雞肉粉：春發(fā)生物科技公司；5’-腺苷酸（5’-adenosine monophosphate，5’-AMP）、5’-肌酸酸鈉（5’-inosine monophosphate，5’-IMP）、5’-胞苷酸（5’-cytidine monophosphate，5’-CMP）、5’-GMP、VB12、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、甘氨酸（glycine，Gly）、抑肽酶標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；其他色譜純?cè)噭┚?gòu)自美國(guó)Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200 Series高效液相色譜系統(tǒng)：美國(guó)安捷倫公司；Mini Pellicon切向流超濾系統(tǒng)：德國(guó)默克密理博公司；?KTA蛋白純化儀：美國(guó)GE公司；ALPHA1-4 LSC冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Christ公司；UV-2550紫外分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 滋味水溶提取物的制備

取20g酵母粉狀酵母抽提物溶于200mL高純水中，室溫充分?jǐn)嚢枞芙?，超聲均質(zhì)10min，抽濾后進(jìn)行下步分離。

1.3.2 不同分子量滋味餾分的超濾分離

滋味水溶性提取物采用切向流超濾系統(tǒng)進(jìn)行分離。溶液依次通過(guò)5 000u、1 000u分子截留量超濾膜包多次分級(jí)分離。分別合并多級(jí)截留液和透出液，冷凍干燥。制得酵母抽提物＞5 000u、＜5 000u、1 000u～5 000u和＜1 000u粗分子質(zhì)量組分。稱質(zhì)量，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 滋味活性肽的凝膠色譜層析分離

YE原始樣品、＜5 000u組分在?KTA蛋白純化系統(tǒng)中進(jìn)一步進(jìn)行凝膠色譜層析分離。系統(tǒng)配有P-900泵，UV-900三波長(zhǎng)檢測(cè)器，pH/900 pH檢測(cè)器及Frac-920自動(dòng)收集器。1g樣品溶于1mL高純水中，各組分經(jīng)一根GE Superdex peptide 10/300 GL色譜柱進(jìn)行分離，上樣量100μL，流動(dòng)相為純水，用1%甲酸調(diào)整pH值為0，流速0.5mL/min。測(cè)定波長(zhǎng)220nm及280nm條件下的吸光度值，樣品被分為7個(gè)餾分（I-VII），分別收集合并，經(jīng)冷凍干燥置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

為了確定酵母抽提物中的多肽分布，同樣條件下用抑肽酶（6512u）、VB12（1343.3u）、還原型GSH（307.3u）、Gly（75u）制作分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 谷胱甘肽含量的測(cè)定

谷胱甘肽是酵母抽提物中明確含有的kokumi物質(zhì)。谷胱甘肽的含量采用5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）法按照趙旭東等[17]的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，母液濃度為0.01g/mL。

1.3.5 5’-核苷酸含量的測(cè)定

5’-核苷酸鈉鹽是重要的umami物質(zhì)，酵母抽提物中5’-核苷酸鈉鹽含量的測(cè)定采用CHO I等[18]的方法經(jīng)一些改進(jìn)進(jìn)行。0.5g樣品溶于25mL水中，煮沸1min，冷卻，過(guò)0.45μm濾膜備用。樣品進(jìn)HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。系統(tǒng)配備G1322A真空在線脫氣系統(tǒng)，G1311A四級(jí)泵，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器及G1316A柱溫箱。色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，柱溫控制為20℃，流動(dòng)相為50mmol KH2PO4，用磷酸調(diào)整pH值為4.3，流速為1mL/min。采用各5’-核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.3.6 感官鑒評(píng)

（1）感官訓(xùn)練

感官鑒評(píng)小組包含有7名成員（3男4女）。為了使成員熟悉感官鑒評(píng)指標(biāo)，進(jìn)行了為期兩個(gè)月的感官鑒評(píng)訓(xùn)練，每天訓(xùn)練的時(shí)間大于1h。用50mmol/L的蔗糖來(lái)訓(xùn)練甜味；用20mmol/L的乳酸來(lái)訓(xùn)練酸味；用20mmol/L的NaCl來(lái)訓(xùn)練咸味；用1mmol/L的咖啡因來(lái)訓(xùn)練苦味；3mmol/L的谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）來(lái)訓(xùn)練鮮味；配制含有10mmol/L谷氨酸鈉和20mmol/L NaCl的鮮味模型溶液，添加5mmol/L的谷胱甘肽來(lái)訓(xùn)練kokumi滋味的鮮味提升作用；配制含有10mmol/L NaCl和雞肉粉的空白雞湯溶液，添加5mmol/L的谷胱甘肽來(lái)訓(xùn)練kokumi滋味的復(fù)雜口感作用。小組商定采用采用含10mmol/L的谷氨酸鈉溶液的滋味作為基本鮮味標(biāo)度。小組成員之間互相交流商議確定描述性語(yǔ)言。所有的訓(xùn)練分3個(gè)部分進(jìn)行，每個(gè)部分間隔5min用清水漱口，整個(gè)訓(xùn)練和評(píng)價(jià)在25～30℃進(jìn)行。

（2）描述性鑒評(píng)實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行描述性鑒評(píng)式樣對(duì)酵母抽提物及其個(gè)分離餾分的umami及kokumi滋味活性進(jìn)行定性描述。相同質(zhì)量濃度的各酵母抽提物原液、酵母抽提物超濾分離餾分、凝膠層析分離餾分均送感官鑒評(píng)小組進(jìn)行描述性鑒評(píng)。對(duì)于鮮度和鮮味提升的鑒評(píng)，采用評(píng)分法，從0～10表示鮮味從沒(méi)有檢出到非常強(qiáng)烈。原液描述鑒評(píng)實(shí)驗(yàn)采用3種模型溶液：MSG（15mmol/L）-NaCl（20mmol/L）模型溶液、（I+G）（0.5g/L）+NaCl（20mmol/L）模型溶液、空白雞湯-NaCl（10mmol/L）模型溶液。各餾分鑒評(píng)只采用標(biāo)準(zhǔn)MSG（15mmol/L）-NaCl（20mmol/L）模型溶液。

（3）感官反饋實(shí)驗(yàn)

為了確定酵母抽提物對(duì)鮮味劑的作用，對(duì)不同質(zhì)量濃度高純酵母抽提物進(jìn)行了感官反饋實(shí)驗(yàn)（sensory-response experiment，SRP）[19]。對(duì)于劑量-反饋實(shí)驗(yàn)（dose-responseexperiment，DRE），一系列質(zhì)量濃度0、0.05g/L、0.25g/L、0.50g/L、2.50g/L、5.00g/L、25.00g/L的酵母抽提物樣品分別添加至MSG（15mmol/L）-NaCl（20mmol/L）模型溶液和（I+G）（0.5g/L）+NaCl（20mmol/L）模型溶液中。感官鑒評(píng)小組對(duì)各溶液的鮮味強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。對(duì)于時(shí)間-反饋實(shí)驗(yàn)（Time-response experiment），取0.5g/L高純酵母抽提物于（I+G）（0.5g/L）+NaCl（20mmol/L）模型溶液，0.3g/L高純酵母抽提物于MSG（15mmol/L）-NaCl（20mmol/L）模型溶液中進(jìn)行鑒評(píng)。從入口（sip）開(kāi)始計(jì)算，要求鑒評(píng)人不斷咂口，每1s對(duì)鮮度進(jìn)行評(píng)分，5s時(shí)吐出（spit），并持續(xù)咂口對(duì)余味進(jìn)行評(píng)分，持續(xù)至10s結(jié)束。所有鑒評(píng)分3組取平均值，同組同人評(píng)分差異不得超過(guò)2個(gè)標(biāo)度。作折線圖來(lái)表示滋味反饋輪廓。

為了保證鑒評(píng)人員安全且高效率鑒評(píng)，所有鑒評(píng)采用啜食技術(shù)[8]。溶液在口中旋轉(zhuǎn)鑒評(píng)而不咽下每個(gè)樣品和樣品鑒評(píng)之間都使用清水進(jìn)行漱口。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

凝膠色譜數(shù)據(jù)采用UNICORN manager分析軟件進(jìn)行分析；HPLC定量數(shù)據(jù)采用Agilent化學(xué)工作站B.02.01進(jìn)行分析；其他差異性分析均采用SPSS 19.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母抽提物umami及kokumi滋味活性的評(píng)價(jià)

2.1.1 描述性鑒評(píng)

3種樣品描述鑒評(píng)結(jié)果見(jiàn)表1，高純酵母抽提物樣品HPYE具有刺舌的苦味和輕微的鮮味，并沒(méi)有體現(xiàn)濃厚和復(fù)雜的鮮味；高I+G樣品HIGYE具有典型的濃厚、持續(xù)的鮮感；普通樣品具有中等苦味和中等的鮮感，有一定的濃厚感。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明了酵母抽提物中的kokumi活性物質(zhì)與I+G具有増鮮、提升濃厚感、持續(xù)口感的作用。

對(duì)比酵母抽提物添加前后模型溶液的滋味特性（表1）。添加前模型溶液的鮮味具有寡淡感，單調(diào)且消失迅速，MSG-NaCl模型溶液還具有不愉快的金屬后味。而添加后的溶液的鮮味被感官鑒評(píng)小組描述為具有一種飽滿、持久的感覺(jué)。這種差異將其與典型鮮味模型區(qū)分開(kāi)來(lái)。對(duì)空白雞湯的實(shí)驗(yàn)表明，酵母抽提物對(duì)湯汁具有增加滋味復(fù)雜度，濃厚度的作用，同時(shí)，還有一定掩腥的效果。另外，酵母抽提物對(duì)I+G較MSG有更強(qiáng)的kokumi作用。

表1 酵母抽提物(YE)及鮮味模型溶液的描述性感官評(píng)價(jià)Table 1 Descriptive sensory evaluation of YE and umami-model solution

2.1.2 感官反饋實(shí)驗(yàn)

圖1 添加酵母抽提物的鮮味模型溶液的劑量-反饋輪廓圖Fig1 Dose-response diagram of umami-model solution with YE

劑量-感官反饋實(shí)驗(yàn)形象地反映了酵母抽提物對(duì)鮮味模型的釋放、消失的作用。由圖1可知，隨著YE用量的增加，兩種模型溶液的鮮味強(qiáng)度逐步增強(qiáng)。對(duì)于MSG-NaCl模型溶液，YE質(zhì)量濃度達(dá)到0.25g/L時(shí)才體現(xiàn)出快速的増鮮效果，到2.5g/L時(shí)達(dá)到最大増鮮效果，感官鑒評(píng)也發(fā)現(xiàn)，在這一YE用量時(shí)，溶液開(kāi)始呈現(xiàn)一定的苦味。對(duì)于I+G+NaCl模型溶液，YE對(duì)其鮮味提升更為明顯，增鮮閾值較低（約0.05g/L），而到5g/L用量時(shí)達(dá)到最大鮮度，也開(kāi)始呈現(xiàn)出一定的苦味。

時(shí)間-反饋實(shí)驗(yàn)揭示了不同樣品鮮味在口中變化，即一種樣品的味覺(jué)時(shí)間輪廓圖。由圖2可知，隨著樣品的啜食，未添加YE的樣品的鮮度迅速達(dá)到最高值，繼而迅速消失；而添加有YE的樣品鮮味釋放時(shí)間長(zhǎng)且消失時(shí)間也較長(zhǎng)，具有持久的鮮感。整體來(lái)看，YE對(duì)I+G及MSG都有明顯的増鮮作用。由圖2可知，在溶液剛吐出時(shí)，4種溶液的鮮度都有一個(gè)回升的過(guò)程，這對(duì)鮮味的后味呈現(xiàn)有很大影響。

圖2 添加酵母抽提物的鮮味模型溶液的時(shí)間-反饋輪廓圖Fig.2 Time-response diagram of umami-model solution with YE

表2 酵母抽提物鮮味和濃厚味相關(guān)化合物定量數(shù)據(jù)Table 2 Quantitative data for compounds related to the umami and kokumi of YE

2.2 超濾滋味餾分的篩選與鑒定

應(yīng)用切向流超濾系統(tǒng)，將YE中的水溶性滋味化合物分為＜1 000u，1 000～5 000u，＞5 000u三個(gè)部分，各部分的含量見(jiàn)表2。由表2可知，高純YE和高I+G YE的＜1 000u組分較普通YE高，且后者更高。這可能是由于較高含量的I+G導(dǎo)致的結(jié)果。普通YE有較高的＞5 000u的組分。這組結(jié)果說(shuō)明在YE中大部分為＜1 000u的組分（純YE含量達(dá)90.2%）。

對(duì)等量3組餾分單獨(dú)及加入模型溶液進(jìn)行感官鑒評(píng)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，在YE中呈現(xiàn)kokumi效果的組分集中在＜1 000u分子質(zhì)量，而1 000～5 000u組分也有輕微的kokumi效果，而＞5 000u組分完全沒(méi)有效果。單獨(dú)品嘗發(fā)現(xiàn)，這些呈強(qiáng)烈kokumi效果的物質(zhì)本身呈苦味，且具有強(qiáng)烈、爽快的刺舌滋味。確定以＜1 000u組分目標(biāo)物，進(jìn)行下一步凝膠色譜層析分離。

表3 酵母抽提物超濾組分的滋味及濃厚味效果評(píng)價(jià)Table 3 Sensory evaluation of kokumi taste of ultrafiltration components of YE

2.3 凝膠色譜分離滋味餾分的篩選與鑒定

經(jīng)凝膠色譜層析分離，共分離出7個(gè)餾分（圖3）。收集并冷凍干燥后，對(duì)各個(gè)組分原樣和添加至模型溶液滋味進(jìn)行鑒評(píng)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，其中GPC-II和GPC-III，本身具有苦味，微鮮和強(qiáng)烈尖刺滋味，添加至模型溶液中具有強(qiáng)烈kokumi 和増鮮效果。經(jīng)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，2種餾分分子質(zhì)量處于200～1 000u之間。初步判斷為含有2～8個(gè)氨基酸的小肽。

圖3 高純酵母抽提物中＜5 000u組分的凝膠過(guò)濾層析色譜圖Fig.3 GPC chromatogram of the ＜5 000 u fraction of high pure yeast extract

2.4 酵母抽提物肽的分子量分布

對(duì)3種YE的全組分進(jìn)行凝膠色譜層析分離測(cè)定其肽段分布，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2結(jié)果可以看出，＜1 000u肽段仍是YE中的主要組成成分（約70%）。對(duì)比3種YE發(fā)現(xiàn)，高I+G YE及普通YE的＜1 000u組分含量偏高，這是由于其中高含量I+G干擾作用所致，同時(shí)對(duì)高I+G YE餾分II和III收集鑒評(píng)發(fā)現(xiàn)，其本身就呈現(xiàn)強(qiáng)烈的酸鮮和kokumi滋味。

表4 酵母抽提物中凝膠過(guò)濾層析餾分單獨(dú)及在模型溶液中的感官評(píng)價(jià)Table 4 Sensory evaluation of single GPC fractions in water and in a model solution

2.5 谷胱甘肽含量

對(duì)3種YE的谷胱甘肽含量進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)定參數(shù)見(jiàn)表5，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。表2結(jié)果顯示，高純YE中谷胱甘肽含量最高（6.828mg/g），普通YE次之，高I+G YE最低。這說(shuō)明純品YE是谷胱甘肽的主要來(lái)源。谷胱甘肽也是比較明確的具有典型kokumi效果的肽類化合物。

表5 酵母抽提物中相關(guān)滋味化合物定量標(biāo)定參數(shù)Table 5 Calibration data used for quantification of taste-active compounds of YE

2.6 5’-核苷酸含量

5’-核苷酸是YE中賦予鮮味的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。對(duì)4種核苷酸5’-AMP、5’-IMP、5’-CMP、5’-GMP的含量進(jìn)行了測(cè)定，標(biāo)定參數(shù)見(jiàn)表5，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。高I+G樣品具有高含量的5’-IMP和5’-GMP，同時(shí)其5’-CMP含量也很高，但是并未在此樣品中發(fā)現(xiàn)5’-AMP，可能是生產(chǎn)過(guò)程中定向發(fā)酵轉(zhuǎn)化的結(jié)果。剩余的2個(gè)樣品中，4種核苷酸均有發(fā)現(xiàn)。且普通YE較高純YE各含量都高。可以得出結(jié)論，純品YE中的核苷酸含量尤其是呈味核苷酸的含量極低（約3.530mg/g），以至于并未與其中所含的kokumi成分協(xié)同發(fā)揮效果，僅有輕微鮮味。可以通過(guò)定向發(fā)酵及人工復(fù)配的方式提高I+G含量，生產(chǎn)出高協(xié)同、高鮮的YE產(chǎn)品。

3 結(jié)論

對(duì)3種YE（高純YE、高I+G YE、普通YE）的umami及kokumi滋味進(jìn)行了評(píng)價(jià)和描述。通過(guò)超濾、凝膠層析對(duì)YE滋味組分進(jìn)行了分離，初步得出分子質(zhì)量處于200u～1000u的肽類，本身具有苦味及強(qiáng)烈刺舌滋味，對(duì)MSG-NaCl、I+G+NaCl、雞湯-NaCl模型溶液具有増鮮，增加復(fù)雜口感及持續(xù)的滿口感的kokumi效果。對(duì)3種YE的粗分子質(zhì)量分布、肽分布、核苷酸含量、GSH含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果得出，YE中＜1000u分子質(zhì)量肽含量很高（約70%），為其主要滋味基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)MSG-NaCl、I+G+NaCl模型溶液做反饋感官鑒評(píng)，得出YE濃度分別達(dá)到0.25g/L、0.05g/L時(shí)開(kāi)始體現(xiàn)出増鮮效果，而在2種模型溶液中分別達(dá)到到2.5g/L，5g/L濃度時(shí)達(dá)到最大増鮮效果，超過(guò)這一濃度時(shí)，溶液開(kāi)始呈現(xiàn)一定的苦味。此外，對(duì)于I+G+NaCl模型溶液，YE對(duì)其鮮味提升更為明顯，增鮮閾值較低。

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