左炔諾孕酮納米載藥緩釋復(fù)合材料對人精子活力及超微結(jié)構(gòu)的影響*

劉凱峰魏 勉呂 芳錢 陽顧方樂王 品嵇玉蓉張曉梅**

1. 江蘇省蘇北人民醫(yī)院, 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心 （揚(yáng)州 225001）; 2. 揚(yáng)州大學(xué)化工學(xué)院

左炔諾孕酮納米載藥緩釋復(fù)合材料對人精子活力及超微結(jié)構(gòu)的影響*

劉凱峰1魏 勉1呂 芳1錢 陽2顧方樂1王 品1嵇玉蓉1張曉梅1**

1. 江蘇省蘇北人民醫(yī)院, 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心 （揚(yáng)州 225001）; 2. 揚(yáng)州大學(xué)化工學(xué)院

目的研究左炔諾孕酮納米載藥聚乳酸（PLA）-聚苯乙烯（PS）復(fù)合材料對人精子活力及超微結(jié)構(gòu)影響。 方法 正常生育男性精液，經(jīng)密度梯度離心處理后分為空膜組、載藥膜組和正常對照組，分別與PLA-PS復(fù)合生物膜（空膜）、左炔諾孕酮納米載藥PLA-PS復(fù)合生物膜（載藥膜）共培養(yǎng)24h，以未加膜培養(yǎng)的精子作為對照，計(jì)算機(jī)輔助精液分析（CASA）檢測精子活力，透射電鏡下觀察各組精子超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果（1）共培養(yǎng)24h后各組間精子活力差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；（2）空膜組精子的超微結(jié)構(gòu)與對照組無明顯差別；（3）載藥膜組精子的頂體波浪狀改變，頂體缺損或消失，質(zhì)膜溶解，線粒體空泡樣變，凋亡精子及崩解精子與空膜組及對照組比較明顯增加。結(jié)論 PLA-PS復(fù)合材料本身對人精子活力及超微結(jié)構(gòu)無明顯影響，加入左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復(fù)合材料可使精子超微結(jié)構(gòu)改變，促進(jìn)精子凋亡，為左炔諾孕酮納米載藥PLA-PS復(fù)合材料作為一種安全有效的新型生物可降解納米載藥宮內(nèi)節(jié)育系統(tǒng)提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

納米醫(yī)學(xué); 左炔諾孕酮; 精子; 避孕

左炔諾孕酮納米載藥緩釋復(fù)合材料已為廣大有避孕要求的女性帶來新的選擇。納米載藥緩釋復(fù)合材料具有不改變藥物性狀，減少藥物的使用量、降低藥物毒副作用、增加藥物的穩(wěn)定性、可提高作用時(shí)間和效果、可有效避免降解核苷酸的作用等優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)將納米粒子復(fù)合于生物材料中利于納米粒子的載藥、緩釋等性能[1]。有研究報(bào)道左炔諾孕酮聯(lián)合十一酸睪酮可抑制精子的生成[2]，但左炔諾孕酮納米載藥緩釋復(fù)合材料對男性精子的活力及精子細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究探討左炔諾孕酮納米載藥聚乳酸（PLA）-聚苯乙烯（PS）復(fù)合材料對人精子活力及超微結(jié)構(gòu)影響，以進(jìn)一步研究生物可降解納米載藥緩釋宮內(nèi)節(jié)育系統(tǒng)的構(gòu)建，為其作為新型避孕系統(tǒng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、左炔諾孕酮納米載藥材料的制備

將PLA、PS及載有左炔諾孕酮納米顆粒的PS在真空干燥箱，60℃的條件下干燥12h；將45g PLA和5g PS或5g 載有左炔諾孕酮納米顆粒的PS加入Haake轉(zhuǎn)矩流變儀進(jìn)行共混，熔融共混溫度為180℃，時(shí)間為8min；在170℃、10MPa的條件下用平板硫化儀將復(fù)合材料壓成片材[3]。

二、人精子懸液的制備

3名精液質(zhì)量正常的男性，禁欲3～7d后手淫法留取精液于無菌取精杯中，液化后充分混勻，采用密度梯度離心法處理精液，即取1.5mL 80% SpermGrad（Vitrolife）加人錐形離心管內(nèi), 用無菌巴斯德吸管緩慢于其液面上方加入1.5mL 40% SpermGrad，將2.0mL精液加至密度梯度上部，400×g，離心15min，將管底精子沉淀吸于5.0mL 試管內(nèi)，加入3.0mL IVF精子洗滌液，重懸洗滌，200×g，離心6min，去除上清液，精子沉淀加入IVF精子處理液制備成5×107/mL密度的精子懸液待用。

三、左炔諾孕酮納米載藥緩釋材料與精子共培養(yǎng)

每份精子懸液分為空膜組、載藥膜組和正常對照組，每組200μl。無菌條件下將PLA-PS復(fù)合材料（空膜）及左炔諾孕酮納米載藥PLA-PS復(fù)合材料（載藥膜）剪成1mm×1mm大小，分別取20片置入200μl 精子懸液中，即為空膜組和載藥膜組，以未添加復(fù)合材料的精子為空白對照，37℃ CO2培養(yǎng)箱孵育24h 后，用計(jì)算機(jī)輔助精液分析（CASA）檢測精子活率及活力，每組重復(fù)3次。

四、精子的透射電鏡檢測

取孵育24h 后的各組精子，1000rmp 離心5min。棄上清液，將沉淀物用2.5%戊二醛固定。 常規(guī)電鏡包埋切片，觀察。每組精子做50個(gè)縱切（精子頭部能見典型核型態(tài)）和50個(gè)橫切（精子尾部見典型軸絲結(jié)構(gòu)）。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、左炔諾孕酮納米載藥復(fù)合材料對人精子活力的影響

空膜組、載藥膜組精子活動(dòng)率（A+B+C級精子）與對照組相比，差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），空膜組、載藥膜組精子活力（A級精子+B級精子）與對照組相比，差異也無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1），說明PLA-PS復(fù)合材料及左炔諾孕酮納米載藥PLA-PS復(fù)合材料對精子活率及活力無明顯影響。

表1 左炔諾孕酮納米載藥緩釋材料對人精子活率及精子活力的的影響

二、左炔諾孕酮納米載藥復(fù)合材料對人精子超微結(jié)構(gòu)的影響

對照組精子：外形正常，結(jié)構(gòu)完整, 雙層膜性結(jié)構(gòu)和赤道板清晰, 頂體內(nèi)含物電子密度中等；核呈梨狀形，核染色質(zhì)電子密度均勻；尾部線粒體分布規(guī)則, 大小形態(tài)較一致，微管結(jié)構(gòu)完好?？漳そM精子超微結(jié)構(gòu)較對照組無明顯變化（圖1）。載藥膜組精子頂體波浪狀改變，頂體缺損或消失，質(zhì)膜溶解，線粒體空泡樣變, 凋亡精子及崩解精子明顯增加（圖2）。

圖1 正常精子和空膜組

圖2 載藥膜組

討 論

聚乳酸（PLA）是一種具有優(yōu)良的生物相容性和可生物降解性的合成高分子材料，具有無毒、無刺激、可塑性好、易于加工成型不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，已被美國食品醫(yī)藥局（FDA）批準(zhǔn)，可用作醫(yī)用手術(shù)縫合線、注射用膠囊、微球及埋植劑等。將PLA作為納米微粒載藥材料應(yīng)用于臨床也是近年來研究熱點(diǎn)[4,5]。但因其親水性差、強(qiáng)度低、脆性高、熱變形溫度低、抗沖擊性差、降解周期難以控制、價(jià)格貴，目前通過增塑、共聚、共混和復(fù)合等改性方法來改進(jìn)PLA的力學(xué)性能，從而更好地滿足生物醫(yī)用以及環(huán)保的應(yīng)用。聚苯乙烯（PS）具有高強(qiáng)度、成本低等優(yōu)點(diǎn)，本研究將PLA和PS按9:1的質(zhì)量比共混合成生物膜，達(dá)到了環(huán)保和力學(xué)性能的平衡。左炔諾孕酮是目前應(yīng)用較廣的避孕藥[6]，是一種強(qiáng)效孕激素，主要作用于下丘腦和垂體，使月經(jīng)中期FSH和LH水平的高峰明顯降低或消失，可以抑制排卵并阻止孕卵著床，同時(shí)使宮頸黏液變稠阻礙精子穿透，其在女性避孕方面是對子宮內(nèi)膜的局限性作用，是可逆的，卵巢分泌激素不受影響[7]。本研究制備了左炔諾孕酮納米載藥緩釋PLA-PS復(fù)合材料，并觀察其對男性精子的活力及精子細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。

精子頂體因含有透明質(zhì)酸酶、頂體蛋白酶、神經(jīng)酰胺酶等，在受精過程中有重要的作用[8]。本研究制備的PLA-PS復(fù)合材料本身對人精子活力及超微結(jié)構(gòu)無明顯影響，證實(shí)了該復(fù)合材料的生物安全性，而左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復(fù)合材料可使精子頂體波浪狀改變，質(zhì)膜溶解，頂體缺損或消失，提示左炔諾孕酮能損壞精子頂體，使精子頂體中所含的各種酶丟失，從而喪失受精能力。

精子中的線粒體通過呼吸底物氧化磷酸化作用產(chǎn)生能量，糖酵解可以通過底物水平磷酸化提供額外的能量，支持人類精子的運(yùn)動(dòng)[9]。本研究制備左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復(fù)合材料可使精子線粒體發(fā)生空泡樣變,理論上可影響琥珀酸脫氫酶（SDH）及乳酸脫氫酶（LDH）的供能，使ATP產(chǎn)生受阻，精子細(xì)胞的前向運(yùn)動(dòng)能力下降。但本研究發(fā)現(xiàn)左炔諾孕酮納米載藥PLA-PS復(fù)合材料對精子活力無明顯影響，可能與樣品例數(shù)少，作用時(shí)間，作用方式有關(guān)，有待增加樣品例數(shù)和增加作用時(shí)間，進(jìn)一步研究。

構(gòu)成精子鞭毛的軸絲復(fù)合體包含9根雙聯(lián)微管，成圓形排列，通過連接蛋白相互連接，并通過放射輻與一對中央微管上中央鞘相連接，各對二聯(lián)體微管之間的相對滑動(dòng)引起尾部的擺動(dòng)，依靠水解ATP以供給能量[9]。本研究未發(fā)現(xiàn)左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復(fù)合材料對精子細(xì)胞的9+1軸絲結(jié)構(gòu)有影響。

由本研究結(jié)果示左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復(fù)合材料可使精子頂體異常，質(zhì)膜溶解，線粒體空泡樣變，促進(jìn)精子凋亡。為左炔諾孕酮載藥PLA-PS復(fù)合材料作為一種新型的宮內(nèi)節(jié)育系統(tǒng)運(yùn)用于臨床提供研究基礎(chǔ)。但這僅是從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上觀察左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復(fù)合材料的作用，若進(jìn)一步揭示作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究，如研究左炔諾孕酮納米載藥的PLA-PS復(fù)合材料對精子細(xì)胞線粒體內(nèi)氧化磷酸化過程的影響等。

1 嵇玉蓉, 魏勉, 張曉梅. 生物可降解納米載藥緩釋宮內(nèi)節(jié)育系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用前景. 中國醫(yī)藥導(dǎo)刊 2012; 14 (12): 2025-2027

2 劉思天, 桂幼倫, 林翠紅, 等. 左炔諾孕酮(LNG)配伍十一酸睪酮(TU)對精子生成抑制差異的研究. 中國計(jì)劃生育學(xué)雜志 2003; 11(12): 734-738

3 張曉梅, 王大新, 呂芳, 等. 生物可降解納米載藥緩釋宮內(nèi)節(jié)育器及其制備方法:中國.201310008740.5[P].2013-4-17

4 Chen CK, Law WC, Aalinkeel R,et al. Biodegradable cationic polymeric nanocapsules for overcoming multidrug resistance and enabling drug-gene co-delivery to cancer cells.Nanoscale2014; 6(3): 1567-1572

5 Zhang C, Chen J, Feng C,et al.Intranasal nanoparticles of basic f broblast growth factor for brain delivery to treat Alzheimer's disease.Int J Pharm2014; 461(1-2): 192-202 6 Beasley A, Schutt-Ainé A. Contraceptive procedures.Obstet Gynecol Clin North Am2013; 40(4): 697-729

7 張莉嘉, 翁梨駒. 左炔諾孕酮宮內(nèi)系統(tǒng)臨床使用五年的安全性研究. 中華婦產(chǎn)科雜志 2001; 36 (11): 675-677

8 張?zhí)N暉, 汪玉寶, 李衛(wèi)華, 等. 苯扎溴銨對人精子細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué) 2002; 19(2): 71-73

9 李宏軍, 李漢忠. 男科學(xué)-男性生殖健康與功能障礙(第3版). 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2013: 62

（2014-01-20收稿）

Effects of sustained-released levonorgestrel nanoparticle composites on human sperm motility and ultrastructure*

Liu Kaifeng1, Wei Mian1, Lv Fang1, Qian Yang2, Gu Fangle1, Wang Pin1, Ji Yurong1, Zhang Xiaomei1**
1.Northern Jiangsu People's Hospital, Clinical College of Yangzhou University, Reproductive Medicine Center, Yangzhou 225001, China; 2.Chemistry and chemical engineering college of Yangzhou university

Zhang Xiaomei, E-mail: zhangxiaomeiyz@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of levonorgestrel-loaded nanoparticle composites on human sperm motility and ultrastructure.MethodsSemen samples from normal reproductive males were collected anddivided into empty biofilm (polylactic acid-polystyrene composite biofilm) group, drug-loaded biofilm(levonorgestrel-loaded nanoparticle polylactic acid-polystyrene composite biofilm) group and normal control group. After co-culture with empty biof lm or drug-loaded biof lm for 24 hours, sperm motilityand sperm ultrastructure were detected by CASA and transmission electron microscope respectively.Results(1) No signif cant differences were observed in sperm motility among groups. (2) Compared with that of the control group, no obvious difference in sperm ultrastructure was found in empty biof lm group. (3) Remarkable differences were observed in drug-loaded biof lmgroup such as wavy change, defect or disappearance of acrosome, plasma membrane dissolved, vacuolar degeneration of mitochondria, as well as a signif cant increase in sperm apoptosis and disintegration of sperm.ConclusionPolylactic acid - polystyrene composites itself has no effects on human sperm motility and ultrastructure, levonorgestrel-loaded nanoparticle polylactic acid-polystyrene composites has obvious effect on human sperm acrosome, plasma membrane, mitochondria and promotes sperm apoptosis, which provides the theoretical basis for further study of biodegradable sustained-released nanoparticle drugloaded intrauterine contraceptive system.

nanomedicine; levonorgestrel; spermatozoa; contraception

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.05.002

R 979.2

資助: 國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81100421）; 江蘇省科技支撐計(jì)劃-社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（BE 2010698）
**

, E-mail: zhangxiaomeiyz@163.com