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    In—Fusion克隆技術(shù)構(gòu)建HBV X基因真核表達(dá)質(zhì)粒

    2014-04-04 16:58:36王鵬劉永蘭雷小英郭瑞娟向安郭晏
    現(xiàn)代儀器與醫(yī)療 2014年2期
    關(guān)鍵詞:乙型肝炎病毒基因克隆

    王鵬 劉永蘭 雷小英 郭瑞娟 向安 郭晏海

    [摘 要] 目的:以血清中乙型肝炎病毒(HBV)DNA為模板,克隆構(gòu)建HBV X蛋白質(zhì)的真核表達(dá)載體pcDNA-HBx。方法:設(shè)計(jì)擴(kuò)增HBV X基因的In-Fusion PCR引物,采用高保真DNA聚合酶分兩段擴(kuò)增HBV X基因序列;采用In-Fusion克隆技術(shù),將兩段X基因擴(kuò)增片段一步克隆入經(jīng)Hind III和Xba I雙酶切的pcDNA3.0真核表達(dá)載體,以構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA-HBX;采用Hind III和Xba I雙酶切和DNA序列測序篩選鑒定重組載體;pcDNA-HBx 轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,Western blot檢測pcDNA-HBx轉(zhuǎn)染細(xì)胞的HBx蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果:In-Fusion PCR引物分兩段擴(kuò)增獲得全長HBx基因序列;In-Fusion獲得克隆的pcDNA-HBx經(jīng)雙酶切篩選得到陽性重組質(zhì)粒,測序分析證實(shí)插入序列正確;轉(zhuǎn)染pcDNA-HBX的HepG2細(xì)胞,Western blot證實(shí)表達(dá)HBx蛋白質(zhì)。結(jié)論:以血清HBV DNA為模板克隆HBV X基因,構(gòu)建了表達(dá)HBV HBx蛋白質(zhì)的真核表達(dá)載體,為HBx蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能研究提供支持。

    [關(guān)鍵詞] 乙型肝炎病毒;HBV X基因;基因克隆;表達(dá)載體;真核表達(dá)

    中圖分類號:R511 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:2055-5200(2014)02-001-05

    慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是肝癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一。HBV 編碼的分子中與肝癌發(fā)生關(guān)系最密切的是X蛋白質(zhì),HBV X基因編碼的X蛋白質(zhì)(the hepatitis B virus X,HBx)具有多種生物學(xué)功能,可與宿主細(xì)胞多種蛋白質(zhì)相互作用,調(diào)控宿主細(xì)胞基因表達(dá),影響宿主細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖與分化等,其對肝細(xì)胞周期與凋亡的影響是HBV致肝癌發(fā)生的重要機(jī)制之一[1-3]。因此,克隆HBV X基因進(jìn)行HBx蛋白生物功能研究具有重要意義。

    由于血清HBV DNA X基因的特殊結(jié)構(gòu),使得克隆X基因較為困難。血清HBV病毒顆粒的基因組長約3.2kb,為帶有缺口的雙鏈不完全環(huán)形結(jié)構(gòu)DNA,稱為松弛環(huán)狀DNA(rcDNA),而X基因位于HBV基因組的1374bp~1838bp,正位于缺口處,而且該區(qū)域?yàn)楦逤G區(qū)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):當(dāng)以血清HBV rcDNA為模板時(shí),用普通PCR一次擴(kuò)增全長X基因,或用PCR分段擴(kuò)增后再用PCR擴(kuò)增拼接的X基因,所獲得全長X基因擴(kuò)增片段經(jīng)常會出現(xiàn)序列缺失現(xiàn)象[4]。

    為克服上述問題,我們采用In-Fusion克隆技術(shù),將分段擴(kuò)增的X基因片段一次連接克隆入真核表達(dá)載體中。In-Fusion克隆技術(shù)是利用In-Fusion Enzyme可準(zhǔn)確將末端帶有15個(gè)相互重疊堿基序列的DNA片段融合連接的特性,將一個(gè)或多個(gè)外源基因片段一次克隆入目的質(zhì)粒中[5-6]。目的克隆基因片段末端的15 bp重疊堿基序列,是通過特定設(shè)計(jì)的In-Fusion引物加到擴(kuò)增片段的末端。In-Fusion HD Cloning Kits 試劑盒可快速準(zhǔn)確地將一個(gè)或多個(gè)外源DNA片段克隆到載體任何位置[7-8]。采用In-Fusion技術(shù),以血清HBV DNA為模板,分段擴(kuò)增并拼接X基因,將X基因準(zhǔn)確地克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.0,獲得了可表達(dá)HBx蛋白質(zhì)重組真核表達(dá)載體。為HBx蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能研究提供實(shí)驗(yàn)條件。

    1 材料與方法

    1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及儀器

    表達(dá)載體pcDNA?3.0購自美國Invitrogen生命技術(shù)公司;高保真PCR擴(kuò)增反應(yīng)液2×Pfu PCR MasterMix、TIANamp病毒DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠DNA 回收試劑盒、感受態(tài)Top10購于天根生化科技(北京)有限公司;限制性內(nèi)切酶HindIII和Xba I、In-Fusion HD EcoDryTM Cloning Kit 購自寶生物工程(大連)有限公司;HepG2細(xì)胞株購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心;鼠抗HBxAg單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠抗體購于圣克魯斯(Santa Cruz)生物技術(shù)公司;NanoDrop2000核酸濃度分析儀(賽默飛世爾科技中國有限公司)。根據(jù)HBV rcDNA X的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),擬分HBX1和HBX2兩個(gè)片段擴(kuò)增X基因,然后進(jìn)行In-Fusion融合連接克隆,所用擴(kuò)增引物(表1)用http://bioinfo.clontech.com/infusion/在線軟件設(shè)計(jì);化學(xué)發(fā)光底物(BeyoECL Plus Reagent A, B,D3308)。

    表1 用于In-Fusion分段拼接克隆的

    PCR引物序列

    引物 引物序列 HBV基因組位置

    P1 GTTTAAACTTAAGCTT CTTACCATGGCTGCTCGG 1368-1385nt

    P2 GTGGTCTCCATGCGACGTGCAG 1618-1597nt

    P3 TCGCATGGAGACCACCGTGAAC 1604-1625nt

    P4 AAACGGGCCCTCTAGA AGGACATGAACATGAGATGATTAGG 1858-1834nt

    注:P1下劃線部分與pcDNA3.0 HindIII位點(diǎn)5端15個(gè)堿基重疊,黑體斜體序列為HindIII識別序列,其余部分為X基因起始區(qū)域序列;P2、P3下劃線序列為反向互補(bǔ)的15個(gè)堿基;P4下劃線部分與pcDNA3.0 XbaI位點(diǎn)3端15個(gè)堿基重疊,黑體斜體序列為XbaI識別序列,其余部分為X基因終止區(qū)域互補(bǔ)序列。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

    1.2.1 血清HBV DNA的PCR擴(kuò)增 采用病毒DNA提取試劑盒分別提取4例HBV感染者血清HBV DNA(HBV病毒血清載量均大于106copies/mL),按圖1方案進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)液配制:2×Pfu PCR MasterMix 12.5?L,引物P1和P2,或引物P3和P4各1?L(15pmol),HBV DNA樣品 3?L,去離子水補(bǔ)至30?L。反應(yīng)程序:98℃預(yù)變性3min;98℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸40s,循環(huán)30次;最后72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,紫外燈下切下270bp處的目的片段,用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。用NanoDrop2000核酸濃度分析儀測定回收的核酸含量。

    圖1 PCR分段擴(kuò)增HBV X基因示意圖

    注:P1和P2引物擴(kuò)增HBX1片段,P3和P4引物擴(kuò)增HBX2片段;兩擴(kuò)增片段間有15個(gè)堿基的重疊序列,P1和P4引物的3端15個(gè)堿基分別與pcDNA3.0載體HindIII和XbaI雙酶切末端15個(gè)堿基序列重疊,上述重疊序列用于In-Fusion Enzyme融合連接克隆。虛線為HBV rcDNA殘缺的正鏈部分。

    1.2.2 In-Fusion連接、轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒鑒定 每個(gè)血清樣品獲得的PCR片段各10ng與HindIII和XbaI線性化pcDNA3.0載體50ng溶于去離子水,溶液總體積為10?L。將該10?L溶液加到一個(gè) In-Fusion HD EcoDry 反應(yīng)管中,用移液器將管內(nèi)In-Fusion HD EcoDry干粉徹底溶解。蓋好蓋后,反應(yīng)管于37℃孵育15min,然后50℃加熱15min滅活I(lǐng)n-Fusion Enzyme,完成融合連接反應(yīng)(原理見圖2),連接反應(yīng)管置于冰上待轉(zhuǎn)化。取In-Fusion連接反應(yīng)液3?L與50?L感受態(tài)Top10混合,按照In-Fusion操作說明進(jìn)行重組載體感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)皿中。37℃過夜培養(yǎng)后,挑取單克隆接種于10mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至菌體增殖對數(shù)增長期時(shí),保存菌種,其余收菌提取重組質(zhì)粒,進(jìn)行HindIII和XbaI雙酶切鑒定和DNA測序。

    圖2 HBx基因擴(kuò)增片段與酶切pcDNA3.0載體In-Fusion克隆連接示意圖

    1.2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,接種5×105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)基為6mL 含10%小牛血清的DMEM,5%CO2培養(yǎng)24h。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%~90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,主要步驟為:6ug 質(zhì)粒DNA溶于600?L無血清DMEM,然后加入12?L TurboFect Transfecion Reagent轉(zhuǎn)染試劑,混勻后室溫放置20min,將DNA和轉(zhuǎn)染劑混合物全部加到60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基中,輕輕搖勻轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。37℃ 5% CO2培養(yǎng)48h,提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。

    1.2.4 Western blot分析 收集細(xì)胞蛋白質(zhì),Bradford測定蛋白質(zhì)含量。取適量蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。將凝膠中的蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(NC膜)上。轉(zhuǎn)膜完畢后,膜用Western封閉液(P0023B) 4℃封閉過夜。加入稀釋(1:500)的鼠抗HBx單克隆抗體(sc-57760,Santa Cruz公司),4℃搖動孵育6h。 以稀釋的(1:1000)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗小鼠IgG作為二抗。加入化學(xué)發(fā)光底物,用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測HBx蛋白質(zhì)條帶。Actin抗體(AA128)作為內(nèi)參。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 PCR擴(kuò)增

    采用In-Fusion PCR引物P1和P2、P3和P4,分別PCR擴(kuò)增血清HBV DNA樣品,每個(gè)樣品獲得266bp和270bp擴(kuò)增產(chǎn)物(見圖3)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,回收凝膠中特異PCR產(chǎn)物條帶,最后獲得30~50ng/?L濃度不等的擴(kuò)增產(chǎn)物水溶液待用。

    圖3 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖譜

    注:1和2、3和4、5和6、7和8分別為不同樣品X基因的X1和X2片段,X1片段大小為266bp,X2片段大小為270bp;M為分子量marker DL2000。

    2.2 In-Fusion連接克隆

    4個(gè)血清HBV DNA 均獲得克隆菌落,重組質(zhì)粒HindIII和XbaI雙酶切鑒定,均可切出長度為491bp插入的X基因的目的片段(見圖4)。對重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序,測序結(jié)果采用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast與HBV genotype C(LOCUS:AB033556)序列進(jìn)行比對(見圖5),結(jié)果4株克隆序列與C基因型HBV X基因序列的同源性均大于97%(480/491=97.76%,481/491=97.96,482/491=98.17%,482/491=98.17%),4株克隆HBV X 基因序列之間均大于98%。證明采用In-Fusion技術(shù)方法將血清HBV DNA X基因克隆入pcDNA3.0。

    圖4 重組質(zhì)粒pcDNA-HBX雙酶切電泳圖譜

    注:1,3分別為兩個(gè)未經(jīng)酶切的pcDNA-HBX質(zhì)粒;2,4分別為經(jīng)HindIII和XbaI雙酶切的圖譜,上方條帶為線性pcDNA質(zhì)粒(5.6kb),下方條帶為目的X基因片段,大小為491bp; M1為D2000分子量標(biāo)準(zhǔn);M2為1kb DNA Ladder分子量標(biāo)準(zhǔn)。

    2.3 Western blot 檢測

    用pcDNA-HBX轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot,采用HBx蛋白質(zhì)特異單克隆抗體進(jìn)行檢查。結(jié)果可見相對分子量約為17 kDa的HBx條帶出現(xiàn),而未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染pcDNA空載體的HepG2細(xì)胞中未檢出HBx蛋白質(zhì)(見圖6)。說明所構(gòu)建的HBx真核表達(dá)載體pcDNA-HBx可在HepG2細(xì)胞中表達(dá)HBx蛋白質(zhì)。

    圖6 Wester blot印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    注:1. 用轉(zhuǎn)染HBx表達(dá)載體pcDNA-HBX的HepG2細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)樣品,顯示有17kDa的HBx蛋白質(zhì)表達(dá);2. 用轉(zhuǎn)染pcDNA3.0質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)樣品;3. 用未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)樣品。M:標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)分子。

    3 結(jié)論

    采用In-Fusion克隆技術(shù)分段擴(kuò)增并克隆帶有缺口的HBX基因,可獲得保真度高的重組克隆。由于HBV DNA 為松弛環(huán)狀DNA,其X基因區(qū)存在兩個(gè)缺口,同時(shí)該區(qū)GC含量較高,尤其是HBX1區(qū)域,GC含量高達(dá)65%[3],因此用傳統(tǒng)的跨越缺口一步PCR擴(kuò)增,獲得全長X基因序列并不容易,經(jīng)常發(fā)生克隆序列存在缺失或插入現(xiàn)象,造成克隆序列失真,影響表達(dá)X蛋白質(zhì)的功能。In-Fusion克隆技術(shù)是基于In-Fusion DNA連接酶可以高效、準(zhǔn)確識別并融合兩個(gè)具有15個(gè)堿基重疊序列的DNA片段,避免了僅依靠退火溫度,控制DNA片段間拼接而造成的非特異結(jié)合。采用分段擴(kuò)增X基因,可以避免X基因序列缺口對擴(kuò)增效率和保真度造成的影響,同時(shí)采用針對GC含量較高區(qū)域的高保真DNA聚合酶PCR反應(yīng)體系,保證擴(kuò)增獲得的兩個(gè)X基因片段具有高保真度。擴(kuò)增獲得的兩個(gè)X基因片段末端間、以及與載體的酶切末端都帶有15個(gè)特異重疊序列,In-Fusion DNA連接酶可以按照序列,準(zhǔn)確地將它們連接起來,獲得重組質(zhì)粒。

    與常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)相比,雖然In-Fusion PCR引物設(shè)計(jì)稍顯復(fù)雜,但通過專業(yè)引物設(shè)計(jì)軟件(http://bioinfo.clontech.com/infusion/),只需提供載體的多克隆序列、限制性內(nèi)切酶以及擴(kuò)增片段的引物序列,即可完成引物設(shè)計(jì);另外,In-Fusion克隆方法不受插入片段3端是否有突出A的影響,因此可以采用任何熱穩(wěn)定性DNA聚合酶進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增[9-11]。

    本研究所用的克隆HBV X基因方法,可準(zhǔn)確、快速從血清HBV DNA樣品中克隆X基因,為HBV感染中X基因研究提供了有效技術(shù)手段。為克隆帶有缺口基因提供借鑒同時(shí),也為多基因克隆以及基因定點(diǎn)突變提供解決方案。

    參 考 文 獻(xiàn)

    [1] Hongxia Fan, Xiaoli Yan, Yu Zhang, et at. Increased Expression of Gp96 by HBx-Induced NF-κB Activation Feedback Enhances Hepatitis B Virus Production[J].PLoS One, 2013, 8(6): 655-688.

    [2] Julie Lucifora1, Silke Arzberger, David Durantel, et al. ΜLrike Protzer. Hepatitis B virus X protein is essential to initiate and maintain virus replication after infection[J]. Journal of Hepatology, 2011, 55(5):996-1003.

    [3] Gilad Doitsh, Yosef Shaul. A long HBV transcript encoding pX is inef?ciently exported from the nucleus[J]. Virology, 2003, 309(2):339–349.

    [4] 李菡,趙國強(qiáng). HB x基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J]. 肝臟,2012,17(5):332-334.

    [5] Sean C. Sleight, Bryan A. Bartley, et al. In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering[J]. Nucleic Acids Res,2010,38: 2624 - 2636.

    [6] Mohamed Karamoko, Sara Cline, Kevin Redding, et al. Lumen Thiol Oxidoreductase1, a Disulfide Bond-Forming Catalyst, Is Required for the Assembly of Photosystem II in Arabidopsis[J]. PLANT CELL, 2011, 23(12): 4462- 4475.

    [7] Tian Luo, Jeeba A. Kuriakose, et al.Ehrlichia chaffeensis TRP120 Interacts with a Diverse Array of Eukaryotic Proteins Involved in Transcription, Signaling, and Cytoskeleton Organization[J]. Infect. Immun, 2011, 79(11): 4382 - 4391.

    [8] Takeshi Shimi, Veronika Butin-Israeli, Stephen A. Adam, et al. The role of nuclear lamin B1 in cell proliferation and senescence[J]. Genes & Dev, 2011,( 25): 2579 - 2593.

    [9] ?ric Bergeron, César G. Albari?o, et al. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus-Encoded Ovarian Tumor Protease Activity Is Dispensable for Virus RNA Polymerase Function[J]. J. Virol., Jan 2009, 84(1): 216 - 226.

    [10] GABILLY S T,DREYFUSS B W,KARAMOKO M,et al.Ccs5, a thioredoxin-like protein involved in the assembly of plastid c-type cytochromes.[J].JBC Papers in Press,2010,285(39):29738-29749.

    [11] Peihua Jiang, Jesusa Josue, Xia Li, et al. Major taste loss in carnivorous mammals[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(13):4956-4961.

    與常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)相比,雖然In-Fusion PCR引物設(shè)計(jì)稍顯復(fù)雜,但通過專業(yè)引物設(shè)計(jì)軟件(http://bioinfo.clontech.com/infusion/),只需提供載體的多克隆序列、限制性內(nèi)切酶以及擴(kuò)增片段的引物序列,即可完成引物設(shè)計(jì);另外,In-Fusion克隆方法不受插入片段3端是否有突出A的影響,因此可以采用任何熱穩(wěn)定性DNA聚合酶進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增[9-11]。

    本研究所用的克隆HBV X基因方法,可準(zhǔn)確、快速從血清HBV DNA樣品中克隆X基因,為HBV感染中X基因研究提供了有效技術(shù)手段。為克隆帶有缺口基因提供借鑒同時(shí),也為多基因克隆以及基因定點(diǎn)突變提供解決方案。

    參 考 文 獻(xiàn)

    [1] Hongxia Fan, Xiaoli Yan, Yu Zhang, et at. Increased Expression of Gp96 by HBx-Induced NF-κB Activation Feedback Enhances Hepatitis B Virus Production[J].PLoS One, 2013, 8(6): 655-688.

    [2] Julie Lucifora1, Silke Arzberger, David Durantel, et al. ΜLrike Protzer. Hepatitis B virus X protein is essential to initiate and maintain virus replication after infection[J]. Journal of Hepatology, 2011, 55(5):996-1003.

    [3] Gilad Doitsh, Yosef Shaul. A long HBV transcript encoding pX is inef?ciently exported from the nucleus[J]. Virology, 2003, 309(2):339–349.

    [4] 李菡,趙國強(qiáng). HB x基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J]. 肝臟,2012,17(5):332-334.

    [5] Sean C. Sleight, Bryan A. Bartley, et al. In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering[J]. Nucleic Acids Res,2010,38: 2624 - 2636.

    [6] Mohamed Karamoko, Sara Cline, Kevin Redding, et al. Lumen Thiol Oxidoreductase1, a Disulfide Bond-Forming Catalyst, Is Required for the Assembly of Photosystem II in Arabidopsis[J]. PLANT CELL, 2011, 23(12): 4462- 4475.

    [7] Tian Luo, Jeeba A. Kuriakose, et al.Ehrlichia chaffeensis TRP120 Interacts with a Diverse Array of Eukaryotic Proteins Involved in Transcription, Signaling, and Cytoskeleton Organization[J]. Infect. Immun, 2011, 79(11): 4382 - 4391.

    [8] Takeshi Shimi, Veronika Butin-Israeli, Stephen A. Adam, et al. The role of nuclear lamin B1 in cell proliferation and senescence[J]. Genes & Dev, 2011,( 25): 2579 - 2593.

    [9] ?ric Bergeron, César G. Albari?o, et al. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus-Encoded Ovarian Tumor Protease Activity Is Dispensable for Virus RNA Polymerase Function[J]. J. Virol., Jan 2009, 84(1): 216 - 226.

    [10] GABILLY S T,DREYFUSS B W,KARAMOKO M,et al.Ccs5, a thioredoxin-like protein involved in the assembly of plastid c-type cytochromes.[J].JBC Papers in Press,2010,285(39):29738-29749.

    [11] Peihua Jiang, Jesusa Josue, Xia Li, et al. Major taste loss in carnivorous mammals[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(13):4956-4961.

    與常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)相比,雖然In-Fusion PCR引物設(shè)計(jì)稍顯復(fù)雜,但通過專業(yè)引物設(shè)計(jì)軟件(http://bioinfo.clontech.com/infusion/),只需提供載體的多克隆序列、限制性內(nèi)切酶以及擴(kuò)增片段的引物序列,即可完成引物設(shè)計(jì);另外,In-Fusion克隆方法不受插入片段3端是否有突出A的影響,因此可以采用任何熱穩(wěn)定性DNA聚合酶進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增[9-11]。

    本研究所用的克隆HBV X基因方法,可準(zhǔn)確、快速從血清HBV DNA樣品中克隆X基因,為HBV感染中X基因研究提供了有效技術(shù)手段。為克隆帶有缺口基因提供借鑒同時(shí),也為多基因克隆以及基因定點(diǎn)突變提供解決方案。

    參 考 文 獻(xiàn)

    [1] Hongxia Fan, Xiaoli Yan, Yu Zhang, et at. Increased Expression of Gp96 by HBx-Induced NF-κB Activation Feedback Enhances Hepatitis B Virus Production[J].PLoS One, 2013, 8(6): 655-688.

    [2] Julie Lucifora1, Silke Arzberger, David Durantel, et al. ΜLrike Protzer. Hepatitis B virus X protein is essential to initiate and maintain virus replication after infection[J]. Journal of Hepatology, 2011, 55(5):996-1003.

    [3] Gilad Doitsh, Yosef Shaul. A long HBV transcript encoding pX is inef?ciently exported from the nucleus[J]. Virology, 2003, 309(2):339–349.

    [4] 李菡,趙國強(qiáng). HB x基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J]. 肝臟,2012,17(5):332-334.

    [5] Sean C. Sleight, Bryan A. Bartley, et al. In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering[J]. Nucleic Acids Res,2010,38: 2624 - 2636.

    [6] Mohamed Karamoko, Sara Cline, Kevin Redding, et al. Lumen Thiol Oxidoreductase1, a Disulfide Bond-Forming Catalyst, Is Required for the Assembly of Photosystem II in Arabidopsis[J]. PLANT CELL, 2011, 23(12): 4462- 4475.

    [7] Tian Luo, Jeeba A. Kuriakose, et al.Ehrlichia chaffeensis TRP120 Interacts with a Diverse Array of Eukaryotic Proteins Involved in Transcription, Signaling, and Cytoskeleton Organization[J]. Infect. Immun, 2011, 79(11): 4382 - 4391.

    [8] Takeshi Shimi, Veronika Butin-Israeli, Stephen A. Adam, et al. The role of nuclear lamin B1 in cell proliferation and senescence[J]. Genes & Dev, 2011,( 25): 2579 - 2593.

    [9] ?ric Bergeron, César G. Albari?o, et al. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus-Encoded Ovarian Tumor Protease Activity Is Dispensable for Virus RNA Polymerase Function[J]. J. Virol., Jan 2009, 84(1): 216 - 226.

    [10] GABILLY S T,DREYFUSS B W,KARAMOKO M,et al.Ccs5, a thioredoxin-like protein involved in the assembly of plastid c-type cytochromes.[J].JBC Papers in Press,2010,285(39):29738-29749.

    [11] Peihua Jiang, Jesusa Josue, Xia Li, et al. Major taste loss in carnivorous mammals[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(13):4956-4961.

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