敦煌固本方對運動性疲勞小鼠肝組織自由基代謝及超微結(jié)構(gòu)的影響*

楊雅麗，李希斌，陳 徹，楚惠媛，耿廣琴，劉浩浩

(甘肅中醫(yī)學院醫(yī)學技術學院甘肅中醫(yī)學院敦煌醫(yī)學與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室，甘肅蘭州730000)

隨著現(xiàn)代競技運動水平的不斷提高，運動員在訓練過程中出現(xiàn)過度訓練的幾率也越來越高。長期過度訓練可引起機體肝組織自由基增多，進而造成肝細胞損傷，影響運動能力［1-2］。敦煌固本方由敦煌古醫(yī)方《茯神湯》［3］加減化裁而來，全方補氣養(yǎng)血、助陽益精，能全面提高機體運動功能。敦煌固本方組方合理，結(jié)構(gòu)嚴謹，配方中所用藥物未見含有運動員違禁成分的相關報道。筆者已經(jīng)研究證實該方有抗疲勞的功效［4］，但其抗疲勞的作用機制尚不清楚。本研究通過建立小鼠游泳運動疲勞模型，探討敦煌固本方對運動性疲勞小鼠肝組織自由基代謝及超微結(jié)構(gòu)的影響，從而找尋該方消除運動性疲勞的作用機制，為該方應用于體育實踐提供理論指導和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康雄性清潔級昆明種小鼠60 只，體質(zhì)量為(20 ±2)g、由甘肅中醫(yī)學院動物實驗中心提供，合格證號為SCXK(甘)-2011 -0001。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22 ± 2)℃，濕度(50 ± 10)%，自由攝食，飲水。

1.2 藥品、試劑與儀器

敦煌固本方由人參、黃芪、白術、岷當歸、陳皮、馬鹿茸等組成，由甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院中藥房提供。將藥材置于藥量5 ～7 倍的蒸餾水中浸泡1 ～2 h，煮沸30 min，過濾，為1 煎;藥渣加3 ～4 倍蒸餾水繼續(xù)煮沸20 min，過濾，為2 煎;將1 煎和2 煎藥液合并后，濃縮至37.5 mL，即配制成2 g 生藥/ mL 溶液，備用。丙二醛(MDA)測試盒(批號20120317)、谷胱甘肽- 過氧化物酶(GSH-PX)測試盒(批號20120414)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(批號20120413)、T-AOC 測試盒(批號20120320)、考馬斯亮藍測試盒(批號20120516)，均購自南京建成生物工程研究所;其余均為國產(chǎn)分析純。BS224S 型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產(chǎn)品;XYJ80 -20型離心機，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品;VIS -723N 型紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司產(chǎn)品;DG3022 型酶聯(lián)免疫檢測儀，華東電子管廠產(chǎn)品;JEOL -1230 透射電子顯微鏡，日本電子公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組與處理

購進小鼠后，先適應性喂養(yǎng)1 周，然后按照體質(zhì)量隨機分為6 組，分別為安靜對照組(control，C)、安靜給藥組(experiment，E)、運動對照組(training control，TC)、運動給藥組(training experiment，TE)，后兩組又各分為力竭運動后即刻組和力竭運動后恢復24 h 組，即TC0、TC24、TE0、TE24。見表1。

表1 動物分組與處理

對照組每日灌胃生理鹽水0.4 mL，給藥組每日灌胃敦煌固本方0.4 mL，基礎飼料飼養(yǎng)。運動組進行6 周的游泳訓練，水溫(30 ±2)℃，水深35 cm，于灌胃后1 h 開始運動，每周游6 d，每周一、周四稱量體質(zhì)量。第1 周游泳40 min/d，以后每周遞加10 min，至第6 周游泳90 min/d。處死動物前稱量其體質(zhì)量，進行最后一次無負重的力竭性游泳，記錄游泳時間。力竭判斷的標準為:小鼠沉入水中超過10 s，且放在平面上無法完成翻正反射［5］。

力竭運動后運動組分為運動后即刻組和運動后恢復24 h 組，運動后即刻組在力竭運動后即刻處死，運動后恢復24 h 組于力竭運動后24 h 處死。

1.4 檢測指標

各組小鼠處死后立即取出肝臟，用預冷的生理鹽水洗凈血污，濾紙吸干，然后用勻漿介質(zhì)低溫勻漿制備質(zhì)量分數(shù)100 g/L 肝勻漿液，0 ～4 ℃下，5 000 r/min離心25 min，取上清液，-20 ℃保存，待測。同時，迅速取肝組織1 mm ×1 mm ×1 mm 左右大小分別放置磷酸緩沖液配制的體積分數(shù)3%戊二醛固定液中，進行電鏡樣品的前固定。

肝組織勻漿SOD、GSH-Px 活性、T-AOC、MDA含量的測定嚴格按照試劑盒說明書操作。透射電鏡制樣及觀察:樣品用體積分數(shù)3%戊二醛固定液固定2 h 以上，磷酸緩沖液漂洗3 次(10 min/次)，質(zhì)量分數(shù)10 g/L 的鋨酸固定1.5 h，磷酸緩沖液漂洗3 次(10 min/次)，500，700，800，900，1 000 g/L 乙醇梯度脫水(10 min/次)，1 000 g/L 丙酮脫水2 次(10 min/次)，1 000 g/L 丙酮與EPON-812 環(huán)氧樹脂混合液浸透，EPON-812 環(huán)氧樹脂包埋，35 ℃、45 ℃、65 ℃聚合，半薄切片，甲苯胺藍染色，光鏡下定位，超薄切片，枸櫞酸鉛和飽和醋酸鈾雙染，JEOL-1230 透射電子顯微鏡觀察、拍照。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計分析軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)(x-)±標準差(s)表示，進行單因素方差分析。以P ＜0.05 為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠游泳至力竭時間對比

運動對照組小鼠游泳至力竭時間平均為(193.45 ±8.69)min，運動給藥組小鼠游泳至力竭時間平均為(263.37 ±19.45)min，給藥組小鼠游泳至力竭時間比對照組延長36.14%。

2.2 各組小鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px 和TAOC 活性對比

在安靜狀態(tài)下，給藥組(E)與對照組(C)對比，肝組織MDA 含量降低，肝組織GSH-Px、SOD 活性和TAOC 升高，差別有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。運動后即刻，小鼠肝組織MDA 含量、SOD、GSH-Px 和T-AOC 的活性都高于安靜組，差別有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);TE0組與TC0組對比，小鼠肝組織MDA 含量下降，GSH-Px、SOD 和T-AOC 升高，差別有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。運動后恢復24 h 組，大部分指標值有所下降，但仍沒有恢復到安靜時水平;TE24組小鼠肝組織SOD、GSH-Px 活性和T-AOC 恢復的程度、MDA 下降的程度均高于TC24組，差別有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 各組小鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px 和T-AOC 活性對比 n=10±s

表2 各組小鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px 和T-AOC 活性對比 n=10±s

注:與C 組對比，* P ＜0.05;與TC0 組對比，# P ＜0.05;與TC24 組對比，△P ＜0.05。

組 別 MDA/(nmol·mgprot -1) SOD/(U·mgprot -1) GSH-Px/(U·mgprot -1) T-AOC/(U·mgprot -1)安靜組 對照組(C) 7.11±0.17 89.82±1.33 536.62±22.50 6.65±0.15給藥組(E) 6.75±0.08* 94.62±2.11* 649.35±24.21* 8.63±0.19*運動后即刻組 對照組(TC0) 14.22±0.15* 118.97±2.05* 736.41±29.80* 12.42±0.21*給藥組(TE0) 12.71±0.21# 131.37±4.65# 854.09±27.11# 16.91±0.20#b運動后恢復24 h 組 對照組(TC24) 9.05±0.23* # 92.22±1.83# 661.65±28.29* # 11.33±0.38* #給藥組(TE24) 8.40±0.12△ 115.88±2.16△ 780.12±36.97△ 14.57±0.23△

2.3 各組小鼠肝細胞超微結(jié)構(gòu)對比

透射電子顯微鏡下:C 組、E 組肝細胞超微結(jié)構(gòu)基本正常。TC0組超微結(jié)構(gòu)損傷最重，以肝細胞細胞器腫脹、溶解、消失，以及肝血竇血管內(nèi)皮細胞腫脹為主要超微結(jié)構(gòu)改變。TE0組小鼠肝組織橫切面的上述結(jié)構(gòu)變化基本與TC0組相似，只是程度明顯減輕。TC24組肝細胞超微結(jié)構(gòu)損傷輕于TC0組，尤其是肝細胞胞質(zhì)細胞器腫脹程度輕于TC0組。TE0與TE24相比后者超微結(jié)構(gòu)損傷輕與前者，但未完全恢復正常水平。見圖1。

圖1 各組小鼠肝細胞超微結(jié)構(gòu)(5 000 ×)

3 討 論

根據(jù)運動性疲勞的相關癥狀，中醫(yī)學可將其歸于“虛勞”等范疇。中醫(yī)學認為:該病多與臟腑功能失調(diào)有關;各種內(nèi)外病因均可導致五臟功能失調(diào)，繼而發(fā)為本病。中醫(yī)學認為:“肝主藏血、主疏泄、主筋，肝氣易于郁結(jié)，以條達為順為貴”?！端貑枴ゐ粽摗吩?“肝主身之筋膜?！薄饵S帝內(nèi)經(jīng)·素問》指出:“動作勞甚謂之罷，肝主筋。”《類經(jīng)·卷三》言:“人之運動，由乎筋力，運動過勞，筋必罷極?！爆F(xiàn)代醫(yī)學認為:肝臟是體內(nèi)重要貯血器官之一，與血液循環(huán)系統(tǒng)的功能有關。由于肝有貯藏血液精華和調(diào)節(jié)血量作用，所以人體臟腑組織(包括肌肉)各方面的活動，都與肝有密切關系。隨著活動量增加，機體對血液的需要量也增加，并由肝為之調(diào)節(jié)。血液充盛，則經(jīng)脈流通，筋骨強勁，關節(jié)活動靈活。此外，中醫(yī)學認為，“久行傷筋”，而筋又主于肝。因此，長時間運動對肝臟會造成一定的影響。

自1978 年Dillard 將自由基理論引入運動醫(yī)學以來，大量的研究和試驗已經(jīng)證實，高強度或長時間運動可導致人或動物的自由基代謝增強［6-7］。肝臟是機體物質(zhì)代謝的重要器官，其中的自由基代謝及抗氧化酶變化較為明顯。肝臟和骨骼肌線粒體呼吸鏈電子傳遞中電子漏形成的超氧自由基是運動性內(nèi)源自由基的主要來源。氧自由基生成增多，脂質(zhì)過氧化反應增強，構(gòu)成了對細胞結(jié)構(gòu)和功能的一系列損害。例如:細胞膜流動性、完整性和通透性的下降;線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損傷，繼而影響電子的傳遞和偶聯(lián)磷酸化的進行;電子漏引起質(zhì)子漏，影響線粒體電子的傳遞和氧化磷酸化的進行等［8-9］。

MDA 是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，是造成細胞膜損傷的物質(zhì)基礎，其含量可以反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映氧自由基對細胞的損傷程度。耐力運動后機體脂質(zhì)過氧化較安靜時加強，MDA 含量升高［10-11］。本實驗結(jié)果與此一致。生物體內(nèi)有產(chǎn)生自由基的體系，也有清除自由基的體系。目前研究得較為清楚的自由基清除體系有酶促與非酶促兩個體系。酶促系統(tǒng)的酶存在于生物體內(nèi)，是最有效、最專一的自由基清除體系，主要有GSH-PX和SOD。GSH-PX是體內(nèi)催化H2O2分解的重要酶，它特異催化GSH 對H2O2的還原反應，而且可以使脂質(zhì)過氧化物變成無毒的羥化物，從而起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。SOD 則是機體直接清除自由基的抗氧化酶，可以分解H2O2和脂質(zhì)過氧化物，阻斷脂質(zhì)過氧化反應，保護細胞免受損傷［12］。體內(nèi)SOD、GSH-PX的協(xié)同作用可特異地清除運動過程中產(chǎn)生的過量自由基，有效地阻止脂質(zhì)過氧化，保護肝臟組織免受過度損傷。在本實驗中，灌服6 周敦煌固本方的小鼠肝組織的脂質(zhì)過氧化水平明顯下降，抗氧化酶SOD、GSH-PX活性顯著升高，這可能是敦煌固本方抗疲勞的機制之一。

機體防御體系的抗氧化能力的強弱與健康程度存在著密切聯(lián)系。影響防御體系的因素很多，如饑餓、碳水化合物供應不足、微量元素的吸收量、激素水平等，而過度疲勞也是一個重要的影響因素?？寡趸芰λ綄Ψ从硻C體的健康狀況具有重要的意義。因此，本實驗從這一角度出發(fā)，觀察敦煌固本方對小鼠肝組織總抗氧化能力的影響。在本實驗中，灌服敦煌固本方各組小鼠總抗氧化能力顯著高于相應對照組，說明敦煌固本方在維護機體健康，提高機體的防御體系，進而防止運動對機體損傷方面有良好的效果。

本實驗結(jié)果顯示:力竭運動使自由基異常增多，引起肝組織超微結(jié)構(gòu)的損傷，使線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器被過度消耗而溶解、斷裂，糖原顆粒大量消耗，肝細胞出現(xiàn)空泡化。肝細胞超微結(jié)構(gòu)的損傷在灌服敦煌固本方后明顯減輕。運動恢復24 h 后，肝細胞超微結(jié)構(gòu)的損傷有所恢復，但灌服敦煌固本方組小鼠恢復效果優(yōu)于對照組。實驗結(jié)果證明了敦煌固本方有抗自由基氧化功能，且對肝細胞線粒體、高爾基體等超微結(jié)構(gòu)的損傷具有保護效果。電鏡檢查結(jié)果與生化檢查結(jié)果可相互印證。

綜上所述，敦煌固本方可顯著提高小鼠運動能力，這與該方能提高肝組織抗自由基氧化的功能，同時，還對運動造成的肝組織超微結(jié)構(gòu)的損傷有明顯的保護作用有關。此為敦煌固本方的深度開發(fā)、利用提供了理論依據(jù)和實驗支持。

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