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    云南省阿昌族人群HPA1~17 基因多態(tài)性的研究①

    2014-03-18 11:41:38張翔凌王冬梅梁格為董偉群
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2014年9期
    關(guān)鍵詞:阿昌族漢族多態(tài)性

    張翔凌 王冬梅 梁格為 李 毅 吳 穗 董偉群

    (昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科,昆明 650032)

    現(xiàn)代許多臨床研究已表明,人類(lèi)血小板抗原(HPA)所導(dǎo)致的血小板同種免疫與新生兒同種免疫性血小板減少癥(NATP)、血小板輸注無(wú)效(PRT)、輸血后紫癜(PTP)、移植相關(guān)血小板減少癥、動(dòng)脈血栓性疾病等相關(guān)[1,2]。而不同人群中的HPA 抗原的分布頻率是與獲得HPA 免疫機(jī)會(huì)正相關(guān)的,本文選擇云南省獨(dú)有的阿昌族為研究對(duì)象,與云南漢族為對(duì)照,采用目前HPA 基因分型最常用的PCR-SSP 技術(shù),對(duì)不同人群中HPA 基因及基因型頻率的分布情況作對(duì)比分析,探討血小板抗原多態(tài)性與地區(qū)、民族的關(guān)系,建立云南少數(shù)民族地區(qū)的血液資源的血小板基因資料庫(kù),同時(shí)有助于探討少數(shù)民族的起源、遺傳、遷移及為法醫(yī)個(gè)體識(shí)別提供數(shù)據(jù)。

    1 對(duì)象與方法

    1.1 研究對(duì)象 2011~2012 年,采集分布在滇南地區(qū)的阿昌族健康人群139 例,昆明地區(qū)健康漢族人群150 例,所有樣本追溯三代無(wú)與其他民族通婚史,彼此間無(wú)血緣關(guān)系,對(duì)所有選取對(duì)象均履行倫理知情告知,并自愿參加。

    1.2 標(biāo)本 每人抽取EDTA-K2 抗凝靜脈血2~3 ml,-80℃凍存待檢。

    1.3 儀器與試劑 PCR 擴(kuò)增儀、水平電泳儀:美國(guó)Bio-Rad 公司,凝膠成像系統(tǒng):Bio-Rad 公司Gel Doc EQ 凝膠成像系統(tǒng)。血小板抗原基因分型試劑盒:長(zhǎng)春博德生物技術(shù)有限公司。

    1.4 DNA 提取 采用碘化鉀法,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的基因組DNA 的紫外吸收峰,分別在波長(zhǎng)260 nm、280 nm 測(cè)定吸光度,用公式計(jì)算DNA 濃度、純度。統(tǒng)一稀釋成1 μg/μl 于-20℃儲(chǔ)存。

    1.5 HPA 基因分型試驗(yàn) 包括PCR 引物混合物(序列特異性引物0.4 μmol/L,內(nèi)對(duì)照引物0.4 μmol/L)、10 ×PCR Buffer 5 μl、dNTP 0.2 mmol/L,Taq 酶0.75 U 和基因組DNA 1 μg,在同一條件下對(duì)HPA1~17 系統(tǒng)同時(shí)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件:94℃、9 min;94℃、1 min;61℃、1 min;72℃、1 min;共35 個(gè)循環(huán);最后72℃,10 min。

    1.6 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) PCR 產(chǎn)物10 μl 在2%瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L 溴化乙錠)中電泳,80 mV 電壓,30 min 結(jié)束電泳,凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察并記錄結(jié)果。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS9.3 統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。不同人群間基因頻率的比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)(精確概率法),基因型之間的比較采用χ2檢驗(yàn)的多個(gè)構(gòu)成比的比較。以P <0.05 為有差異,P <0.01 為有顯著性差異。

    2 結(jié)果

    2.1 阿昌族HPA1~17 系統(tǒng)基因檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)結(jié)果 139 例阿昌族人群HPA1-17 系統(tǒng)基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1,圖1 為阿昌族人群HPA1~17 系統(tǒng)基因分型的凝膠成像圖:阿昌族人群中HPA-7、HPA9~14,HPA-16 抗原系統(tǒng)的基因型均為aa,未檢測(cè)出相應(yīng)的等位基因HPA-b;HPA-1,2,4,5,6,8,17 抗原系統(tǒng)的基因型以aa 居多,HPA-3,15 具有較高的雜合度,HPA-3aa、3ab、3bb 的基因型頻率分別為31.65%、48.2%、20.15%,HPA-15aa、15ab、15bb 的基因型頻率分別為35.25%、36.69%、28.06%。經(jīng)χ2檢驗(yàn),阿昌族人群樣本的基因檢測(cè)結(jié)果符合H-W 遺傳平衡定律。

    2.2 漢族組人群HPA1~17 系統(tǒng)基因和基因型頻率分布 150 例漢族人群中HPA7~14,HPA16,17 抗原系統(tǒng)的基因型均為aa,未檢測(cè)出相應(yīng)的等位基因HPA-b;HPA1,2,4,5,6 抗原系統(tǒng)的基因型以aa 居多,HPA3,15 具有較高的相同的雜合度,其aa、ab、bb 的基因型頻率分別為34%、46.67%、19.33%,結(jié)果見(jiàn)表2。

    表1 139 例阿昌族組人群HPA1~17 系統(tǒng)基因和基因型頻率分布(n=139)Tab.1 Gene and genotype frequencies of HPA1 -17 in Achang population(n=139)

    表2 150 例漢族人群HPA1~17 系統(tǒng)基因和基因型頻率分布(n=150)Tab.2 Gene and genotype frequencies of HPA1 -17 in Han population(n=150)

    圖1 阿昌族122 號(hào)樣本凝膠成像圖Fig.1 HPA Gel doemnent of sample in Achang population

    2.3 阿昌族與漢族人群間基因頻率的比較 兩個(gè)民族的HPA-7,HPA9~13,HPA-14,16 系統(tǒng)的基因型均為aa,均未檢測(cè)出相應(yīng)的等位基因HPA-b;兩個(gè)民族的HPA-3 與HPA-15 均具有較高的多態(tài)性;與對(duì)照組(漢族)人群比較,阿昌族HPA-1a 系統(tǒng)有差異(P <0.05),結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3 阿昌族與漢族人群間基因頻率的比較表Tab.3 Comparison of gene frequencies between Achang population and Han population

    3 討論

    現(xiàn)代許多臨床研究已表明,人類(lèi)血小板抗原(HPA)所導(dǎo)致的血小板同種免疫與新生兒同種免疫性血小板減少癥(NATP)、血小板輸注無(wú)效(PRT)、輸血后紫癜(PTP)、移植相關(guān)血小板減少癥、動(dòng)脈血栓性疾病等相關(guān)、對(duì)此類(lèi)疾病的診斷、預(yù)防和治療均需以血小板同種抗原的基因分型為基礎(chǔ)。

    云南省匯集了全國(guó)最多的少數(shù)民族,少數(shù)民族間進(jìn)行血液輸注的可能性非常大,故非常有必要進(jìn)行其他少數(shù)民族HPA 基因多態(tài)性的研究,特別近年來(lái)部分少數(shù)民族人口數(shù)量下降,對(duì)于保存其民族遺傳學(xué)和人類(lèi)學(xué)資料也具有重要意義;目前國(guó)內(nèi)外對(duì)HPA 研究可見(jiàn)報(bào)道,其中,國(guó)內(nèi)目前對(duì)漢族人群的HPA 研究較多[3,4],少數(shù)民族HPA研究報(bào)道甚少[5,6],而云南省少數(shù)民族血小板同種抗原的研究尚未見(jiàn)報(bào)道[7]。

    本文以云南省特有的少數(shù)民族阿昌族為研究對(duì)象,對(duì)不同人群中HPA 基因及基因型頻率的分布情況作對(duì)比分析,探討血小板抗原多態(tài)性與地區(qū)、民族的關(guān)系,研究結(jié)果顯示:從HPA 基因分型結(jié)果可看出(見(jiàn)表1~3),云南地區(qū)阿昌族健康人群中的HPA1~17 基因頻率與同地區(qū)的漢族接近,也呈現(xiàn)各自自身的特點(diǎn)。兩個(gè)民族的HPA-7、HPA9~13、HPA-14,16 系統(tǒng)的基因型均為aa,均未檢測(cè)出相應(yīng)的等位基因HPA-b;兩個(gè)民族群樣本的HPA1~6、HPA-8,13,15,17 系統(tǒng)中a 的基因頻率 均大于50%;阿昌族與漢族人群的HPA-3 與HPA-15 系統(tǒng)均具有較高的多態(tài)性,明顯較其他系統(tǒng)具有較高遺傳多態(tài)性,通過(guò)對(duì)MP 值的計(jì)算發(fā)現(xiàn),HPA-3、15 系統(tǒng)易發(fā)生因?yàn)殄e(cuò)配輸注產(chǎn)生同種免疫反應(yīng)。阿昌族HPA-1a 基因頻率與漢族人群相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,為提高血小板輸注的安全性和有效性,應(yīng)高度重視HPA 同種免疫作用,同時(shí)關(guān)注是否存在不同民族之間血小板抗原基因差異而導(dǎo)致的免疫作用。根據(jù)本次調(diào)查的HPA 基因多態(tài)性頻率,可以預(yù)測(cè)阿昌族人群發(fā)生血小板同種免疫的風(fēng)險(xiǎn),在臨床上,HPA-1a、HPA-3 與HPA-15 為具有重要意義的血小板抗原系統(tǒng)。對(duì)少數(shù)民族進(jìn)行HPA 分型,可對(duì)預(yù)防和診斷由HPA 同種免疫所造成的疾病,建立少數(shù)民族地區(qū)血小板供者庫(kù)提供依據(jù)。HPA 作為人類(lèi)遺傳多態(tài)性標(biāo)記,還可應(yīng)用于法醫(yī)個(gè)體識(shí)別,人類(lèi)進(jìn)化與遷徙,以及某些疾病相關(guān)性的研究。

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    [3]陳揚(yáng)凱,葉 欣,夏文杰,等.血小板特異性基因(HPA-1-17)在廣州地區(qū)人群中分布的多態(tài)性研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2010,26(8):699-702.

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    [6]鄧燕玲,覃小梅,黃軍垣.人血小板抗原基因多態(tài)性在廣西壯族、瑤族、苗族、侗族及仫姥族老年人中的表達(dá)差異[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2012,32(6):2499-2501.

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