B族G蛋白偶聯(lián)受體PAC1可調(diào)控表達(dá)體系的建立

李梅，余榕捷，鐘佳萍，崔澤凱，楊延旭，張華華

1 暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生物工程研究所，廣東 廣州 510630

2 廣東醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，廣東 東莞 523808

B族 G蛋白偶聯(lián)受體 (G-protein couple receptor, GPCR) PAC1是神經(jīng)肽垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽 (Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide，PACAP) 的特異受體[1-2]。PAC1主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，周圍神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng) (如腦，丘腦，耳蝸，視網(wǎng)膜，腎上腺及胰島等)；主要介導(dǎo)PACAP的神經(jīng)遞質(zhì)[3]、神經(jīng)調(diào)質(zhì)[4]、神經(jīng)保護(hù)[5-6]、抗神經(jīng)損傷[7]及調(diào)控神經(jīng)再生的功能[2-8]，是開發(fā)治療帕金森病、老年癡呆癥、手足舞蹈癥等神經(jīng)損傷藥物的首選靶受體。PAC1除了在神經(jīng)組織及神經(jīng)內(nèi)分泌器官特異性高表達(dá)外，PAC1的高表達(dá)還被發(fā)現(xiàn)與某些生理病理過程密切相關(guān)。如：在神經(jīng)腫瘤細(xì)胞及神經(jīng)內(nèi)分泌瘤細(xì)胞高表達(dá)[9]；PAC1在老年大鼠的腦部表達(dá)水平顯著隨齡升高[10]；PAC1在受到輻射損傷及毒素?fù)p傷的胸腺顯著表達(dá)上調(diào)[11]；慢性壓力導(dǎo)致 PAC1在腦部終紋床核的表達(dá)水平上調(diào)[12]，最新的Nature報道：恐懼導(dǎo)致PAC1在小鼠杏仁核表達(dá)顯著上調(diào)，表明PAC1成為壓力癥的分子標(biāo)簽[13]。鑒于PAC1介導(dǎo)了 PACAP 的多種生物學(xué)功能且其表達(dá)水平與某些生理病理過程密切相關(guān)，因此構(gòu)建PAC1可調(diào)控表達(dá)的體系對于進(jìn)一步研究 PAC1介導(dǎo)的生物學(xué)功能的作用機(jī)制有重大的價值。

四環(huán)素表達(dá)調(diào)控系統(tǒng) (Tet-on expression system) 是由Gossen等[14]建立的基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，可以實現(xiàn)用四環(huán)素及其衍生物強(qiáng)力霉素(Doxycycline, Dox) 來調(diào)控目的基因的表達(dá)。在Tet-On控制表達(dá)系統(tǒng)中，當(dāng)Dox存在時，可誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)；當(dāng)Dox從系統(tǒng)中除去后，目的基因轉(zhuǎn)錄關(guān)閉，可以實現(xiàn)目的基因的定時、定點、定量表達(dá)和關(guān)閉[15]。Tet-On系統(tǒng)操作方便，適于臨床應(yīng)用[16]，并已被廣泛應(yīng)用于多種疾病的基因治療研究中[17-18]，被認(rèn)為是目前理想的真核生物基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。本研究中的Tet-On控制表達(dá)系統(tǒng)由兩部分組成：一個是四環(huán)素調(diào)節(jié)元件載體pTet-on advance，含有抗G418基因，表達(dá)四環(huán)素抑制子；另一個是反應(yīng)質(zhì)粒pTRE-PAC1-EYFP，表達(dá)目的基因PAC1-EYFP，并位于四環(huán)素操縱子控制的啟動子下游。因此，利用此系統(tǒng)調(diào)控基因表達(dá)時，需將2個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同一個細(xì)胞中。本研究選擇中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO) 細(xì)胞系CHO-K1，此細(xì)胞已被證明既不表達(dá)PACAP，也不表達(dá)PAC1[19]。此外，為了方便檢測和示蹤，本研究采用了PAC1的C端融合增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP, enhanced yellow fluorescent protein) 的融合蛋白PAC1-EYFP。本研究擬利用Tet-On控制表達(dá)系統(tǒng)建立PAC1-EYFP體外可調(diào)控表達(dá)的細(xì)胞系PAC1-Tet-CHO，實現(xiàn)PAC1-EYFP的Dox依賴的可控表達(dá)，為PAC1生物學(xué)活性的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

含有PAC1-EYFP基因的質(zhì)粒pEYFP-PAC1-EYFP為本實驗保存[20]。pTet-on advanced，pTRE-tight載體購自Clontech公司。G418為Gibco BRL 產(chǎn)品。潮霉素 (Hygromycin) 為Roche產(chǎn)品。強(qiáng)力霉素 (Doxycycline, Dox)，MTT(Methylthiazoletetrazolium bromide) 均為Sigma產(chǎn)品。Lipofectamine LTX 購自美國生命技術(shù)公司(GIBCO BRL)。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Not Ⅰ購自美國New England Biolabs (NEB) 公司。

1.2 方法

1.2.1 pTRE-PAC1-EYFP表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

本研究的PAC1基因大小為1 407 bp，EYFP基因大小為750 bp，融合基因PAC1-EYFP大小為2 157 bp，通過限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ對質(zhì)粒pEYFP-PAC1-EYFP進(jìn)行雙酶切，將酶切后的PAC1-EYFP基因片段再亞克隆入 pTRE-Tight載體的EcoRⅠ和NotⅠ位點間，構(gòu)建重組表達(dá)載體pTRE-PAC1-EYFP。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E. coli DH5α，針對PAC1基因編碼框的1–300 bp的設(shè)計并合成鑒定引物 (F1：5′-ATGGCCAGAACC CTGCAGCTC-3′, F2：5′-AAAGCCAGAATCCCC TATGGT-3′)，用PCR對重組子進(jìn)行初步鑒定，陽性克隆將擴(kuò)增出對應(yīng)于PAC1基因的一條300 bp的PCR產(chǎn)物，并通過利用位于pTRE-Tight質(zhì)粒多克隆位點上游的引物進(jìn)行基因測序，鑒定重組質(zhì)粒pTRE-PAC1-EYFP中PAC1-EYFP基因的存在及其序列的正確性。

1.2.2 四環(huán)素調(diào)節(jié)元件載體 pTet-on advanced的轉(zhuǎn)染、篩選及鑒定

用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基 (無抗生素)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)CHO細(xì)胞，待細(xì)胞80%成片時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法按說明書操作，將四環(huán)素調(diào)節(jié)元件載體pTet-on advanced轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞。細(xì)胞在37 ℃、CO2孵箱中培養(yǎng)6–10 h后，換含5% FBS的DMEM培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞1∶5傳代，待細(xì)胞貼壁后換10% FBS、800 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，用梯度稀釋法篩選抗G418的細(xì)胞克隆Tet-CHO。

1.2.3 四環(huán)素反應(yīng)元件載體pTRE-PAC1-EYFP和線性潮霉素基因的共轉(zhuǎn)染、篩選及鑒定

同1.2.2采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將帶有熒光基因的反應(yīng)質(zhì)粒pTRE-PAC1-EYFP和線性潮霉素基因 (the Linear Hygromycin Marker)，共轉(zhuǎn)染至上述帶有質(zhì)粒pTet-on advanced的陽性細(xì)胞克隆Tet-CHO中，線性潮霉素基因用來標(biāo)化該載體，用10% FBS、500 μg/mL潮霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，梯度稀釋法篩選抗潮霉素的陽性克隆PAC1-Tet-CHO。

1.2.4 Dox誘導(dǎo)PAC1-EYFP的表達(dá)及檢測

將PAC1-Tet-CHO細(xì)胞系培養(yǎng)至60%–70%成片時，分別加入不同濃度強(qiáng)力霉素 (Dox) 誘導(dǎo)，Dox的終濃度分別為0、10、100、1 000 μg/mL，每個濃度做5個重復(fù)；在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h。分別用倒置熒光顯微鏡IX71下觀察不同濃度Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞中表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量；用生物多功能發(fā)光儀 (激發(fā)波長為465 nm±30 nm, 發(fā)射波長為525 nm±30 nm) 檢測不同濃度Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度；分別提取不同濃度Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞中的蛋白，經(jīng)BCA法定量后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后，用抗兔源抗PAC1一抗 (購自Satacus公司)、二抗孵育。用TBS清洗后顯色，檢測PAC1-EYFP蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞穩(wěn)定性的鑒定

將篩選出的表達(dá)PAC1-EYFP蛋白的細(xì)胞株分別在含有或不含有潮霉素的培養(yǎng)基中連續(xù)傳10代，期間監(jiān)測目的蛋白的Dox誘導(dǎo)表達(dá)，以判斷轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定性。

1.2.6 MTT法檢測細(xì)胞的生長曲線

用MTT法檢測Tet-on表達(dá)控制系統(tǒng)中PAC1-EYFP的不同表達(dá)水平對細(xì)胞增殖活性的影響，在96孔板中培養(yǎng)PAC1-Tet-CHO細(xì)胞至60%–70%成片時，加入梯度濃度 (0–1 000 μg/mL)的Dox，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，饑餓2–6 h，加入MTT的終濃度為0.5 mg/mL，37 ℃孵育4 h，終止反應(yīng)，每孔加150 μL異丙醇，37 ℃避光孵育10 min，于酶標(biāo)儀570 nm處檢測，630 nm為參考波長，測定各孔光吸收值，設(shè)置無細(xì)胞孔為對照，連續(xù)測5 d。

2 結(jié)果

2.1 pTRE-PAC1-EYFP表達(dá)載體的構(gòu)建

PAC1基因大小為 1 407 bp，融合基因PAC1-EYFP大小為 2 157 bp，將質(zhì)粒 pEYFPPAC1-EYFP用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后電泳回收2 157 bp的目的片段，連接到pTRE-Tight載體上，得到重組表達(dá)載體 pTRE-PAC1-EYFP。采用方法1.2.1中針對PAC1基因編碼框1–300 bp的引物，用PCR的方法對重組質(zhì)粒pTRE-PAC1-EYFP進(jìn)行初步鑒定，發(fā)現(xiàn)重組載體pTRE-PAC1- EYFP可擴(kuò)增出與預(yù)計相符的 300 bp產(chǎn)物 (圖1)，然后利用位于 pTRE-Tight質(zhì)粒多克隆位點上游的引物進(jìn)行基因測序，經(jīng)測序確定重組質(zhì)粒pTRE-PAC1-EYFP中PAC1-EYFP的基因序列與預(yù)期結(jié)果一致 (圖略)，說明成功構(gòu)建了pTRE- PAC1-EYFP的真核表達(dá)載體。

圖1 PCR鑒定載體pTRE-PAC1-EYFP的構(gòu)建Fig. 1 Identification of vector pTRE-PAC1-EYFP by PCR. M1: DNA marker DL2000; 1: pTRE-PAC1-EYFP;2: pTRE-Tight.

2.2 梯度濃度 Dox誘導(dǎo) PAC1-EYFP的表達(dá)和檢測

將pTet-on-advance質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞，經(jīng)800 μg/mLG418篩選獲得Neor陽性細(xì)胞克隆Tet-CHO，而后將重組質(zhì)粒 pTRE-PAC1-EYFP和線性潮霉素基因共轉(zhuǎn)染至Tet-CHO細(xì)胞，經(jīng)500 μg/mL潮霉素篩選，挑取新的陽性細(xì)胞克隆PAC1-Tet-CHO 擴(kuò)大培養(yǎng)。用梯度濃度(0–1 000 μg/mL) Dox 誘導(dǎo) PAC1-EYFP 表達(dá)，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察黃色熒光蛋白的表達(dá)(圖 2A)，發(fā)現(xiàn)Dox誘導(dǎo)PAC1-EYFP的表達(dá)有顯著的濃度依賴性；沒有Dox 誘導(dǎo)的細(xì)胞中檢測不到黃色熒光蛋白，而隨著 Dox濃度的遞增則檢測到黃色熒光蛋白的量相應(yīng)增高。生物多功能發(fā)光儀檢測和Western印跡檢測結(jié)果也顯示，隨著 Dox濃度的增加，PAC1-EYFP的熒光強(qiáng)度(圖2B) 和蛋白表達(dá)水平 (圖2C) 均相應(yīng)增加。結(jié)果表明，利用 Tet-on控制表達(dá)系統(tǒng)實現(xiàn)了PAC1-EYFP的Dox依賴的可控表達(dá)。

圖2 熒光顯微觀察、熒光定量檢測和Western印跡檢測梯度濃度Dox誘導(dǎo)表達(dá)PAC1-EYFPFig. 2 Induced expression of PAC1-EYFP by different concentrations of Dox in PAC1-Tet-CHO cells detected by fluorescence metry assay and Western blotting. (A) The fluorescence microscope showed that the fluorescence signals representing the expression of EYFP-tagged PAC1 increased following the increase of the concentration of Dox(0?1 000 μg/mL). (B) The fluorescence metry assay showed that the fluorescence density of the PAC1-Tet-CHO cells representing the expression of EYFP-tagged PAC1 increased following the increase of the concentration of Dox(0?1 000 μg/mL). (*P<0.01, 100 μg/mL Dox or 1 000 μg/mL Dox compared with 0 μg/mL Dox; # P<0.01, 1 000 μg/mL Dox compared with 100 μg/mL Dox). (C) Western blotting assayed showed the expression of PAC1-EYFP using β-Actin as a control. PAC1-Tet-CHO cells treated with various concentrations Dox 0 μg/mL, 100 μg/mL, 1 000 μg/mL respectively.

2.3 可調(diào)控表達(dá)細(xì)胞系PAC1-Tet-CHO的穩(wěn)定性評價

將篩選的細(xì)胞株P(guān)AC1-Tet-CHO在含Hygromycin 的培養(yǎng)基中連續(xù)傳10代，每代細(xì)胞均用Dox誘導(dǎo)并在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞仍能高效地可誘導(dǎo)表達(dá)PAC1-EYFP，且表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，說明我們構(gòu)建的細(xì)胞系穩(wěn)定性很好。其中第5代和第10代細(xì)胞的表達(dá)檢測結(jié)果見圖3A、B。此外，即使將細(xì)胞株P(guān)AC1-Tet-CHO在未加Hygromycin的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞仍能高效保持Dox依賴的可誘導(dǎo)表達(dá)PAC1-EYFP，結(jié)果見圖3C，說明該細(xì)胞株具有傳代穩(wěn)定性。

2.4 MTT檢測不同濃度Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞生長曲線

用MTT法于酶標(biāo)儀570 nm處檢測，630 nm為參考波長，測定各孔光吸收值，設(shè)置無細(xì)胞孔為對照，連續(xù)測5 d，并繪制生長曲線圖發(fā)現(xiàn)，PAC1-EYFP的表達(dá)水平與細(xì)胞的增殖活性密切正相關(guān) (圖4)；其中，Dox 誘導(dǎo)組 (100 μg/mL、1 000 μg/mL) 的增殖活性顯著高于非Dox誘導(dǎo)組(0 μg/mL)，高濃度Dox (1 000 μg/mL) 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性明顯高于低濃度Dox (100 μg/mL) 誘導(dǎo)組。

圖4 MTT檢測不同濃度Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞生長曲線圖Fig. 4 Grow curves of PAC1-Tet-CHO cells incubated with different concentrations of Dox. The cells viabilities assayed by MTT showed that 1 000 μg/mL Dox and 100 μg/mL Dox led to the higher cells viabilities(*P<0.01, 1 000 μg/mL Dox and 100 μg/mL Dox compared with 0 μg/mL Dox), while 1 000 μg/mL Dox produced significantly higher cells viabilities than 100 μg/mL Dox (#P<0.01, 1 000 μg/mL Dox compared with 100 μg/mL Dox).

3 討論

在真核細(xì)胞的調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)中，Tet-on控制表達(dá)系統(tǒng)具有嚴(yán)密性、特異性、高效性等優(yōu)點[21-22]，誘導(dǎo)劑即為常用的抗生素四環(huán)素及其衍生物，在低于其毒性劑量時就能發(fā)揮誘導(dǎo)作用，加之則可人為控制目的基因的表達(dá)水平，有利于模擬該基因在生理、病理

等不同狀態(tài)下的作用特點和機(jī)制。本研究利用 Tet-on控制表達(dá)系統(tǒng)成功建立可控表達(dá) PAC1-EYFP的細(xì)胞系PAC1-Tet-CHO，不僅表達(dá)水平有顯著的Dox濃度依賴性，而且體系非常穩(wěn)定，從圖3中可以看到細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)10代仍能高效地可誘導(dǎo)表達(dá)PAC1-EYFP。這樣可調(diào)控且穩(wěn)定表達(dá)PAC1-EYFP的細(xì)胞系完全可以滿足今后對PAC1生物學(xué)功能研究的需要。

PAC1參與了介導(dǎo)PACAP促神經(jīng)細(xì)胞增殖和抗凋亡的功能[2-8]，本研究發(fā)現(xiàn)PAC1賦予細(xì)胞其表達(dá)水平依賴的增殖活性——用MTT法檢測細(xì)胞的生長曲線，圖 4中顯示同樣培養(yǎng)條件下，加Dox濃度高時，細(xì)胞的增殖活性較高，未加Dox的對照組增殖活性顯然低于加Dox實驗組，表明PAC1表達(dá)水平越高，其賦予細(xì)胞的增殖活性越強(qiáng)。結(jié)合PAC1在受損細(xì)胞及腫瘤中高表達(dá)的發(fā)現(xiàn)[9-11]，這些結(jié)果提示，細(xì)胞可能通過調(diào)節(jié)的受體 PAC1的表達(dá)水平實現(xiàn)對配體的反應(yīng)程度，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和抗凋亡的活性。本研究首次揭示了PAC1表達(dá)水平與細(xì)胞增殖活性的正相關(guān)性。

總之，本研究首次利用了 Tet-on控制表達(dá)系統(tǒng)成功實現(xiàn)了 Dox依賴的 PAC1-EYFP在CHO細(xì)胞的可控表達(dá)，構(gòu)建了遺傳穩(wěn)定的PAC1-Tet-CHO細(xì)胞系，并且首次獲得了PAC1表達(dá)水平與細(xì)胞增殖活性正相關(guān)的數(shù)據(jù)，這些研究不僅有助于詮釋高表達(dá) PAC1的生理學(xué)與病理學(xué)的作用和意義，而且為以PAC1為靶點的藥物開發(fā)提供了新的理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。例如，或許可以用提高PAC1自身表達(dá)水平的方法替代原有的配體激活的方法來開啟 PAC1所介導(dǎo)的信號通路，實現(xiàn)以PAC1為靶點的相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，借此避免PACAP等多肽配體激活非特異受體而造成的副作用；還或許對于和腫瘤或某些病理過程密切相關(guān)的 PAC1的高表達(dá)，可以通過抑制其高表達(dá)實現(xiàn)對某些腫瘤 (神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤) 或某些病理過程 (如創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙，壓力性應(yīng)激障礙等) 的干預(yù)和治療等。

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