毛囊來源的神經(jīng)嵴干細(xì)胞修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損

張路，張潔元，李兵倉，劉爭(zhēng)，劉彬

1 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715 2 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所 創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042 3 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715 4 重慶醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室 神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶 400016

周圍神缺損修復(fù)一直是人們關(guān)注的問題[1-3]。周圍神缺損修復(fù)的目的是為了實(shí)現(xiàn)缺損部位感覺和 (或) 運(yùn)動(dòng)機(jī)能的部分乃至完全恢復(fù)。感覺功能檢測(cè)[4]和運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)[5]是評(píng)價(jià)周圍神缺損修復(fù)效果的比較直觀的方法。目前，國(guó)內(nèi)外所報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果大多處于組織學(xué)和電生理水平[6-8]。為了實(shí)現(xiàn)周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的更好效果，本領(lǐng)域的各項(xiàng)探索仍具有其必要性。對(duì)軸突生長(zhǎng)提供一個(gè)相對(duì)封閉的微環(huán)境[9]是神經(jīng)導(dǎo)管設(shè)計(jì)的初衷。由于考慮到物質(zhì)交換的問題，在神經(jīng)導(dǎo)管管壁預(yù)留一系列的孔隙也是目前普遍采用的思路，也有研究表明神經(jīng)導(dǎo)管管壁孔隙的存在會(huì)阻滯軸突生長(zhǎng)的進(jìn)程[9]。因此，在本研究中，采用了孔隙率低的導(dǎo)管。聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(Poly lactic acid co glycolic acid copolymer, PLGA)[10]、細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)[11]由于具有良好的生物相容性及生物可降解性而被應(yīng)用于人工神經(jīng)的研究中。ECM的主要成分為膠原和其他一些對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和粘附有促進(jìn)作用的物質(zhì)[12]，在本研究中將ECM預(yù)置在PLGA神經(jīng)導(dǎo)管中是試圖為種子細(xì)胞的生長(zhǎng)和粘附提供三維支架，并促進(jìn)其生長(zhǎng)。利用種子細(xì)胞修復(fù)周圍神經(jīng)缺損是一個(gè)被普遍認(rèn)同的學(xué)術(shù)思路。雪旺氏細(xì)胞 (Schwann cells,SC)[13]、嗅球成鞘細(xì)胞 (Olfactory ensheathing cells, OEC)[14]、骨髓基質(zhì)細(xì)胞 (Bone marrow stromal cells, BMSC)[15]、神經(jīng)干細(xì)胞 (Neural stem cells, NSC)[16]等都被作為種子細(xì)胞。它們對(duì)促進(jìn)周圍神經(jīng)缺損修復(fù)均有正效應(yīng)，但都未實(shí)現(xiàn)其完全修復(fù)。影響周圍神經(jīng)缺損修復(fù)效果的因素很多，探索其他種子細(xì)胞或許能為這一問題的解決提供更多的方案。毛囊來源的神經(jīng)嵴干細(xì)胞 (Epidermal Neural Crest Stem Cell, EPI-NCSC)由于取材方便，具有多種分化潛能[17-18]，是一種具有良好應(yīng)用前景的組織工程種子細(xì)胞。目前，在神經(jīng)缺損修復(fù)領(lǐng)域中，EPI-NCSC主要被應(yīng)用于脊髓損傷的修復(fù)。研究證實(shí)，在脊髓損傷處移植EPI-NCSC，在術(shù)部局部可觀察到結(jié)構(gòu)和功能的部分恢復(fù)[19]以及神經(jīng)再生和髓鞘形成[20]。

為了探討 EPI-NCSC對(duì)周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)作用，本研究以成年GFP、SD大鼠觸須墊為材料，原代培養(yǎng)EPI-NCSC?？疾炱潴w外性質(zhì)，并以其為種子細(xì)胞，將其等量與ECM混合后，預(yù)置入 PLGA導(dǎo)管中，橋接 SD大鼠坐骨神經(jīng)10 mm距離的缺失。在移植4周后，通過感覺功能檢測(cè)，神經(jīng)行為學(xué)觀測(cè)和術(shù)部組織學(xué)觀察，來探討EPI-NCSC對(duì)周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)作用，從而為相關(guān)研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PLGA材料的制備

將PLGA (85：15, Sigma) 溶于三氯甲烷，制備成5% (W/V) 的溶液，置于玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，在通風(fēng)櫥中揮發(fā) 48 h，以制備厚度為 25 μm 的PLGA膜。用自制模具制備內(nèi)徑為1.5 mm，壁厚0.5 mm，長(zhǎng)度為15 mm的PLGA導(dǎo)管。將二者進(jìn)行γ射線(2.5 Mrad)照射滅菌，在無菌條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 EPI-NCSC的原代培養(yǎng)

EPI-NCSC 的原代培養(yǎng)按文獻(xiàn)[17]報(bào)道的方法進(jìn)行。取成年GFP、SD大鼠 (雌性，體重200 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)1只，過量麻醉致死，取其觸須墊，解剖出完整毛囊，切除毛囊球部，剖開結(jié)締組織鞘，取出毛囊外根鞘，保持隆突部的完整。置于被鼠尾膠原包埋過的培養(yǎng)皿中，25 min后加入1.5 mL培養(yǎng)液(含達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's medium, DMEM)/F12 1：1，10%FBS，2% B27，20 ng/mL bFGF)，37 ℃﹑5% CO2培養(yǎng)。3 d后半量換液，6 d后剔除毛囊，0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液同前，每3天換液一次。

1.3 EPI-NCSC的鑒定

EPI-NCSC 的鑒定按文獻(xiàn)[17]報(bào)道的方法進(jìn)行。將粘附有細(xì)胞的載玻片用PBS漂洗3次，用4%多聚甲醛常溫下固定30 min，PBS漂洗3次各5 min，用1%BSA室溫封閉30 min，傾去液體，加入小鼠抗Nestin (1∶100, Abcam, USA)和兔抗SOX10 (1∶1 000, Abcam, USA) 4 ℃孵育24 h。PBS漂洗3次，每次5 min。加入Alexa Flour 594山羊抗兔IgG (1∶50，碧云天，中國(guó))和Cy5山羊抗小鼠IgG (1∶50，碧云天，中國(guó))37 ℃孵育1 h。PBS漂洗3次，每次10 min。室溫晾干避光，抗熒光淬滅劑 (KPL，USA) 封片。熒光顯微鏡下觀察。

1.4 EPI-NCSC與PLGA膜的共培養(yǎng)及其觀察

將濃度為 1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種至PLGA膜上，在37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。同時(shí)以相同數(shù)量的細(xì)胞接種到被鼠尾膠原包被的蓋玻片上，作為對(duì)照組培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，取材用熒光顯微鏡。掃面電鏡樣品置入固定液，4 ℃冰箱固定24 h，樣品經(jīng)過梯度脫水后再噴金。

1.5 EPI-NCSC在PLGA膜表面的相對(duì)增殖率及初期附著率的噻唑藍(lán)(Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色分析

用明膠預(yù)襯 96孔板后，在各孔中滴加 5%(W/V) 的PLGA三氯甲烷溶液，迅速揮發(fā)干，用γ射線照射滅菌，接種濃度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液 (n=3)。在37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)4、8、12、16 h，去上清液，加入MTT工作液100 μL (含DMEM/F12+20% FBS培養(yǎng)基稀釋，終濃度為1 mg/mL) 37 ℃孵育4 h，再加入150 μL二甲基亞砜 (DMSO) 溶液，DDHZ-300臺(tái)式恒溫振蕩器37 ℃孵育30 min直至結(jié)晶產(chǎn)物完全溶解，用未經(jīng)處理的96孔板為對(duì)照組。用全波長(zhǎng)酶標(biāo)測(cè)定儀 (Thermo, USA) 在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其OD570值。根據(jù)以下公式折算初期附著率。

初期附著率=OD570值(實(shí)驗(yàn)組)/OD570(對(duì)照組)×100%

按以上相同的方法處理后，分別測(cè)定在第1、3、5和7天的OD570值，根據(jù)以下公式折算細(xì)胞相對(duì)增殖率 (Relative growth rate, RGR)。

RGR=OD570值(實(shí)驗(yàn)組)/OD570值(對(duì)照組)×100%

1.6 細(xì)胞周期及DNA倍體分析

將EPI-NCSC與PLGA膜進(jìn)行共培養(yǎng)，分別在第1、3、5和7天取PLGA膜，用0.25%的胰蛋白酶+0.02% EDTA消化收集細(xì)胞，DMEM/F12+20% FBS培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，75%酒精重懸固定，制成密度為1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，4 ℃過夜。1 000 r/min離心 5 min，去除酒精固定液，加入碘化丙啶(PI，50 μg/mL) 染料 (含 RNA 酶 A 0.1 mg/mL)，4 ℃孵育25 min。用Epics XLMCL型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)公式計(jì)算出樣品細(xì)胞的DNA指數(shù) (DNA index，DI)，增殖指數(shù)PI，以確定PLGA材料對(duì)EPI-NCSC的細(xì)胞周期、DNA含量及倍體水平的影響。以單獨(dú)培養(yǎng)的EPI-NCSC為對(duì)照。

DI=實(shí)驗(yàn)組-G1期細(xì)胞百分比/對(duì)照組-G1期細(xì)胞百分比

PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.7.1 模型的建立與分組

將體重200?220 g SD大鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)20只隨機(jī)分為2組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組為EPI-NCSC細(xì)胞懸液和ECM的混合液25 μL注射入PLGA神經(jīng)導(dǎo)管；對(duì)照組將等量的 ECM 和 DMEM 的混合液注射入PLGA神經(jīng)導(dǎo)管。用3%戊巴比妥鈉40?50 mg/kg腹腔注射麻醉，俯位固定。在右側(cè)坐骨神經(jīng)走向處切開皮膚，暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，追蹤坐骨神經(jīng)至梨狀肌下緣5 mm處，切除該點(diǎn)以下的坐骨神經(jīng)，形成10 mm的缺損。取PLGA導(dǎo)管套接于神經(jīng)斷端，8-0無創(chuàng)縫線縫合神經(jīng)外膜于PLGA導(dǎo)管上。依次縫合肌間膜、皮膚，皮下注射青霉素10萬單位/kg。術(shù)前1 d及術(shù)后1周內(nèi)每日腹腔注射環(huán)孢霉素4 mg/kg。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)。

1.7.2 組織標(biāo)本的獲取和制備

在術(shù)后第4周，取實(shí)驗(yàn)組大鼠。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定，剖胸顯露心臟，剪開右心耳，同時(shí)左心室插管，快速灌注生理鹽水100–200 mL，待流出液體清亮后，灌注4%多聚甲醛200 mL左右。灌注結(jié)束后，取材橋接管內(nèi)再生組織10 mm，繼續(xù)后固定6 h，20%蔗糖飽和至組織沉底。冰凍縱行切片，片厚10 μm，熒光顯微鏡和進(jìn)行H.E染色觀察。

1.7.3 感覺功能檢測(cè)

感覺功能檢測(cè)按文獻(xiàn)[4]報(bào)道的方法進(jìn)行。將大鼠輕輕固定，后足浸入熱水浴中 (50 ℃)，記錄后足回縮時(shí)間，以回縮時(shí)間的長(zhǎng)短來量化痛溫覺。術(shù)后每周均進(jìn)行回縮反射檢測(cè)，先測(cè)實(shí)驗(yàn)側(cè)，再測(cè)正常側(cè)作為對(duì)照。對(duì)照組方法同上。注意后足浸入熱水浴中若5 s后仍無回縮，后足立即移出熱水浴，以防止組織損傷。

1.7.4 運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)

運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)按文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方法進(jìn)行。自制大鼠足印行走盒，寬10 cm，長(zhǎng)80 cm。記錄清晰的大鼠雙側(cè)后足足印。測(cè)量雙側(cè)后足的印長(zhǎng) (Print length, PL)，趾展 (Toe spread, TS)，中間趾展(Intermediary toe spread, ITS)，每只至少測(cè)量 5對(duì)足印，術(shù)后1周開始測(cè)量，每周測(cè)量一次。按照Bain-Mackinnon-Hunter坐骨神經(jīng)功能指數(shù)公式計(jì)算出SFI值。

SFI= –38.3×PLF+109.5×TSF+13.3×ITF–8.8

其 中 PLF=(EPL–NPL)/NPL， TSF=(ETS–NTS)/NTS，ITF=(EIT–NIT)/NIT。E代表實(shí)驗(yàn)側(cè)(Experimental side)，N 代表正常側(cè) (Normal side)。正常大鼠的SFI值約為0，坐骨神經(jīng)完全損傷后SFI值約為–100。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPI-NCSC的原代培養(yǎng)及鑒定

GFP大鼠毛囊在體外培養(yǎng)3 d時(shí)，EPI-NCSC從隆突處爬出 (圖1A)。EPI-NCSC細(xì)胞經(jīng)第一次傳代后，在熒光顯微鏡下被激發(fā)出綠色熒光(圖 1B)。行 Nestin (圖 1C) 和 SOX10 (圖 1D) 熒光免疫組化鑒定,細(xì)胞呈陽性，胞漿被激發(fā)出藍(lán)色和紅色熒光，細(xì)胞核陰性。由此可以確定原代培養(yǎng)的細(xì)胞為EPI-NCSC。

2.2 EPI-NCSC與PLGA膜的共培養(yǎng)及其觀察

圖1 EPI-NCSC的原代培養(yǎng)及鑒定Fig. 1 Culture and immunofluorescence staining for EPI-NCSC. (A) Hair follicle and EPI-NCSC on the 3th day. (B) Observed with fluophot. (C)Immunofluorescence staining of Nestin. (D)Immunofluorescence staining of SOX10. (E)Immunofluorescence staining of SOX10 and Nestin.

圖2 EPI-NCSC與PLGA膜的共培養(yǎng)觀察Fig. 2 EPI-NCSC co-cultured with materials. (A)EPI-NCSC on a coverslip (fluophot). (B) EPI-NCSC on a PLGA membrane (fluophot). (C) EPI-NCSC on a coverslip (SEM). (D) EPI-NCSC on a PLGA membrane(SEM).

EPI-NCSC在分別與被鼠尾膠原包被的蓋玻片 (圖2 A,C) 和PLGA膜 (圖2 B,D) 共培養(yǎng)3 d后，在熒光顯微鏡 (圖2 A,B) 和掃描電子顯微鏡 (圖2 C,D) 下均觀察到了細(xì)胞。在蓋破片上的細(xì)胞形態(tài)大部分呈梭形，有的突起多，細(xì)胞之間靠分支相連；在 PLGA膜上細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，有突起，細(xì)胞聚集生長(zhǎng)。

2.3 EPI-NCSC細(xì)胞在PLGA膜表面的相對(duì)增殖率及初期附著率的MTT分析

EPI-NCSC在接種PLGA膜上4 h到16 h，OD值呈增加趨勢(shì)，略低于對(duì)照組，但兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異 (P＞0.01) (圖 3)。EPI-NCSC在PLGA膜上的初期粘附率為89.7%。

EPI-NCSC接種于 PLGA膜上 1?7 d，OD值與對(duì)照組均呈遞增態(tài)勢(shì)，但兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異 (P＞0.01) (圖4)。EPI-NCSC在1、3、5、7 d的細(xì)胞相對(duì)增殖率分別為 89.3%、87.6%、85.6%和96.6%。

2.4 細(xì)胞周期及DNA倍體分析

PLGA組的G0/G1期 (靜止期/DNA合成前期) 細(xì)胞百分比不斷減少，S期 (DNA合成期)細(xì)胞百分比不斷增加，與對(duì)照組 EPI-NCSC的細(xì)胞周期變化趨勢(shì)相同，PLGA組的G2/M期細(xì)胞百分比與正常的細(xì)胞百分比變化趨勢(shì)也相同,兩者無顯著性差異(*P> 0.01) (圖5)，說明PLGA并不影響EPI-NCSC的細(xì)胞周期變化。

圖3 EPI-NCSC在PLGA膜上的粘附試驗(yàn) (MTT)Fig. 3 Adhesion of EPI-NCSC on a PLGA membrane(MTT).

圖4 EPI-NCSC在PLGA膜上的增殖試驗(yàn) (MTT)Fig. 4 Development of EPI-NCSC on a PLGA membrane (MTT).

PLGA組在1?7 d DNA指數(shù) (DI值) 均在1.0±0.1范圍內(nèi) (表1)，為正常DNA二倍體細(xì)胞，證實(shí)PLGA材料對(duì)EPI-NCSC無致癌性，二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)機(jī)體無害。

PLGA組在1?7 d增殖指數(shù) (PI值) 與對(duì)照組增值變化相同，都有增加趨勢(shì)。兩者無顯著性差異 (P＞0.01) (圖 6)。PLGA 對(duì) EPI-NCSC的增值變化影響不大。

2.5 術(shù)部的形態(tài)學(xué)觀察

在移植4周后，PLGA導(dǎo)管仍然保持著管狀形態(tài) (圖7A)。移植體內(nèi)被細(xì)胞充滿，多數(shù)細(xì)胞顯示出綠色熒光 (圖7E, E′)。與正常坐骨神經(jīng)組織 (圖7B, B′) 相比，移植體內(nèi)的細(xì)胞排列無順序，細(xì)胞之間比較緊密，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。在ECM/DMEM 組(對(duì)照)中 (圖 7C, C′)，移植體組織結(jié)構(gòu)松散，組織間有泡狀空隙，細(xì)胞數(shù)量比細(xì)胞移植組明顯減少。

圖5 EPI-NCSC的細(xì)胞周期分析Fig. 5 Cell cycle of EPI-NCSC. (A) Percentage of G0/G1 phase cells. (B) Percentage of G2/M phase cells.(C) Percentage of S phase cells. *Values are not significantly different at P>0.01 (t-test). **Values are not significantly different at P>0.05 (t-test).

表1 不同時(shí)間點(diǎn)的DI值Table 1 DI values of time

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)PI值變化Fig. 6 PI values of time.

圖7 移植4周后術(shù)部神經(jīng)的形態(tài)Fig. 7 Defected sciatic nerve after four weeks of transplant. (A) Area of transplant. (B) Cross section of normal sciatic nerve (H.E). (B') Longitudinally cut section of normal sciatic nerve (H.E). (C) Cross section of control group (H.E) . (C') Longitudinally cut section ofcontrol group (H.E). (D) Cross section of experiment group (H.E). (D') Longitudinally cut section of experiment group (H.E). (E) Longitudinally cut section of experiment group (fluophot). (E') Cross section of experiment group (fluophot).

2.6 感覺功能檢測(cè)

正常大鼠后足回縮時(shí)間在1.46?1.49 s之間。術(shù)后 1周各組實(shí)驗(yàn)側(cè)的后足回縮時(shí)間較正常側(cè)延長(zhǎng)2.5 s左右，與正常側(cè)回縮時(shí)間有顯著性差異 (P＜0.01)。術(shù)后3 周實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)感覺功能的改善，對(duì)照組無明顯的改善。在 4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組感覺功能繼續(xù)好轉(zhuǎn)，回縮時(shí)間恢復(fù)至(2.93±0.02) s，而對(duì)照組 (在PLGA導(dǎo)管中，以等量的ECM/DMEM代替EPI-NCSC和ECM的混合物) 感覺功能仍未改善 (表2)。

2.7 運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)

正常大鼠的SFI值為0。術(shù)后1周，由于后足足印長(zhǎng)度急劇增加，趾展、中間趾展的大幅減小，各組SFI值均降至–97~–100之間。術(shù)后3周實(shí)驗(yàn)組SFI值有顯著提高，對(duì)照組SFI值無明顯提高。在4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組SFI值繼續(xù)增加，而對(duì)照組提高不明顯 (表3) (P＜0.05)。

表2 術(shù)后各組回縮反射時(shí)間Table 2 Time of leg contraction (s,±s, n=5)

表2 術(shù)后各組回縮反射時(shí)間Table 2 Time of leg contraction (s,±s, n=5)

*Values are significantly different at P<0.01 (t-test).

表3 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組SFI值Table 3 SFI value of time (±s, n=5)

表3 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組SFI值Table 3 SFI value of time (±s, n=5)

*Values are significantly different at P<0.05 (t-test).

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞符合大鼠EPI-NCSC[17]的鑒定特征。通過與 PLGA膜的共培養(yǎng)，EPI-NCSC在 PLGA膜上的初期粘附率為89.7%。EPI-NCSC在1、3、5、7 d時(shí)，在PLGA上的細(xì)胞相對(duì)增殖率分別為 89.3%、87.6%、85.6%和 96.6%。這些都說明 PLGA材料對(duì)EPI-NCSC具有很好的親和性。通過細(xì)胞周期及DNA倍體分析，結(jié)果顯示EPI-NCSC在與PLGA的共培養(yǎng)中，其細(xì)胞周期的變化趨勢(shì)與單獨(dú)培養(yǎng)的 EPI-NCSC相同。說明 PLGA并不影響EPI-NCSC的細(xì)胞周期變化。

在移植4周后，PLGA導(dǎo)管仍然保持著管狀形態(tài)，這是由 PLGA在動(dòng)物體內(nèi)的降解性質(zhì)所決定的。移植體內(nèi)被細(xì)胞充滿，多數(shù)細(xì)胞顯示出綠色熒光。這說明神經(jīng)斷端的細(xì)胞和外源性添加的 EPI-NCSC共同參與了神經(jīng)缺損修復(fù)。這些新生組織細(xì)胞組成，可能包含了雪旺氏細(xì)胞[21]、成纖維細(xì)胞和早期神經(jīng)元或成熟神經(jīng)元，同時(shí)也可能包含了處于不同分化階段的EPI-NCSC。將EPI-NCSC移植入嚴(yán)重?fù)p傷的神經(jīng)處，該細(xì)胞大部分轉(zhuǎn)化為雪旺氏細(xì)胞，雪旺氏細(xì)胞為神經(jīng)元的再生提供營(yíng)養(yǎng)支持。與正常坐骨神經(jīng)組織相比，移植體內(nèi)的細(xì)胞排列較為松散，這說明，需要為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供更久的時(shí)間，以達(dá)到更好的修復(fù)效果。在 ECM/DMEM對(duì)照組中，神經(jīng)組織沒有再生，移植體內(nèi)成空泡狀，細(xì)胞數(shù)量明顯少于細(xì)胞移植組。這說明，外源性添加 EPI-NCSC對(duì)于神經(jīng)缺損的修復(fù)是必要的。

在感覺功能檢測(cè)試驗(yàn)中，大鼠后足回縮的動(dòng)作，部分可能是由隱神經(jīng)的感覺作用以及腿部皮膚、肌肉和韌帶的彈性回縮。但是，在本實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后各組回縮反射時(shí)間隨時(shí)間變化呈現(xiàn)出一個(gè)縮短的趨勢(shì)，這說明坐骨神經(jīng)的功能得到了部分恢復(fù)。

在運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)試驗(yàn)中, 術(shù)后各組SFI值隨時(shí)間變化體現(xiàn)出一個(gè)提高的趨勢(shì)，這也說明坐骨神經(jīng)的功能得到了部分恢復(fù)。但是，為了更明確地闡明其修復(fù)作用，還有很多工作需要開展。比如，需要進(jìn)一步地闡明在移植部位 (圖7E, E′)，坐骨神經(jīng)缺損在修復(fù)過程中，新生組織的細(xì)胞組成及其來源，以及新增細(xì)胞與軸突的間的排列方式等。

4 結(jié)論

PLGA材料對(duì)EPI-NCSC具有很好的生物相容性。外源性添加 EPI-NCSC對(duì)于神經(jīng)缺損的修復(fù)是必要的。在4周的時(shí)間內(nèi)，EPI-NCSC使10 mm缺失的坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能得到了部分恢復(fù)。

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