高效液相色譜法測(cè)定永川豆豉中的6 種有機(jī)酸

葉秀娟，鄭 炯,2,*，索化夷,2，闞建全,2

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶），重慶 400715）

高效液相色譜法測(cè)定永川豆豉中的6 種有機(jī)酸

葉秀娟1，鄭 炯1,2,*，索化夷1,2，闞建全1,2

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶），重慶 400715）

建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定永川豆豉中酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸和琥珀酸6 種有機(jī)酸含量的方法。通過(guò)色譜條件的優(yōu)化，確定永川豆豉中6 種有機(jī)酸含量測(cè)定的最佳色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.01 mol/L磷酸氫二銨（pH 2.5）和甲醇溶液，流速0.6 mL/min、柱溫30 ℃、檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。在此條件下，上述6 種有機(jī)酸可得到很好的分離和測(cè)定。該方法各種酸的線性范圍為0.001～1.000 mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.999 9以上，精密度檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.07%～0.36%（n=5），重復(fù)性檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.97%～3.04%（n=5），回收率在94.89%～104.28%之間。該方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可應(yīng)用于永川豆豉中6 種有機(jī)酸的同時(shí)快速測(cè)定。

永川豆豉；高效液相色譜法；有機(jī)酸；測(cè)定

豆豉是以整粒大豆或豆瓣為原料，經(jīng)浸泡、蒸煮、制曲、發(fā)酵等工序加工而成的，具有極高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療價(jià)值的大豆發(fā)酵食品。豆豉歷史悠久、風(fēng)味獨(dú)特，是佐餐調(diào)味的佳品，富含大豆多肽、異黃酮、皂苷、低聚糖、溶栓酶等多種功能性成分[1]，因其具有抗氧化[2]、降壓[3]、降血糖[4]等多種保健功能而深受人們喜愛(ài)。豆豉按其發(fā)酵微生物的不同，主要可分為曲霉型、毛霉型、根霉型和細(xì)菌型，其中毛霉型豆豉以重慶的永川豆豉為代表。永川豆豉起源于300多年前[5]，外觀光亮油黑，味道清香回甜，富含人體所需的18 種氨基酸及獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)保健功能成分。

有機(jī)酸的測(cè)定通常采用滴定法、分光光度法、氣相色譜法、薄層色譜法、酶法等[6-8]，然而各種方法都存在一定的局限性，如化學(xué)法預(yù)處理步驟較多、易受干擾，且所用時(shí)間較長(zhǎng)；酶法每次只能測(cè)定一種有機(jī)酸；薄層色譜法只能定性和半定量，測(cè)量精度較差；氣相色譜法僅適用于測(cè)定揮發(fā)性有機(jī)酸，且需衍生處理，操作繁瑣，準(zhǔn)確度較低等。近年來(lái)，高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）法因具有分離效率高、準(zhǔn)確度和精密度好等優(yōu)點(diǎn)被越來(lái)越多地用于快速檢測(cè)領(lǐng)域。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)豆豉的研究主要集中在大豆異黃酮[9-10]，豆豉的營(yíng)養(yǎng)和生理功能[11-15]以及發(fā)酵微生物的分離鑒定[16-18]等方面，而有關(guān)豆豉中有機(jī)酸的研究較少[19]。有機(jī)酸是永川豆豉中主要的呈味及風(fēng)味物質(zhì)，其含量的多少與豆豉的風(fēng)味密切相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬建立HPLC同時(shí)測(cè)定永川豆豉中酒石酸等6 種有機(jī)酸的分析方法，并對(duì)有機(jī)酸組分及含量進(jìn)行檢測(cè)，以期為永川豆豉風(fēng)味特性和發(fā)酵品質(zhì)的研究提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用材料為永川豆豉食品有限公司經(jīng)天然制曲發(fā)酵而成的永川毛霉型豆豉，原料大豆產(chǎn)地為吉林省。

酒石酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、醋酸、乳酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；磷酸氫二銨、磷酸（分析純）成都市科龍化工試劑廠；甲醇（色譜純） 天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（含二極管陣列檢測(cè)器）日本島津公司；ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱 美國(guó)Agilent公司；Milli-Q超純水儀美國(guó)密理博公司；KQ-100B型超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；Centrifuge5810高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；PB-10標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì) 德國(guó)賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：A g i l e n t Z O R B A X S B-A q（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；流動(dòng)相A為磷酸氫二銨，并用H3PO4調(diào)節(jié)pH值，流動(dòng)相B為甲醇；梯度洗脫（洗脫條件：0～20 min，5%～30%B；20～25 min，30%～50%B；25～30 min，50%B；30～35 min，50%～5%B；35～45 min，5%B）；流速為0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。

1.3.2 樣品處理

參照楊君等[20]的方法并加以改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取切細(xì)的2.5 g豆豉，研磨后轉(zhuǎn)入到100 mL離心管中，加入50 mL超純水，于超聲波清洗機(jī)中提取30 min，使有機(jī)酸充分浸出，冷卻后4 000 r/min離心20 min，上清液過(guò)濾到100 mL的容量瓶中，殘?jiān)尤?5 mL超純水再提取，合并上清液，用超純水定容至刻度。待測(cè)液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，將濾液置于2 mL的進(jìn)樣瓶中待色譜測(cè)定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密稱取酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸各50 mg，用超純水溶解并定容至25 mL容量瓶中，搖勻，得2.00 mg/mL的混合有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)母液。分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)混合母液，用超純水稀釋成1.000、0.500、0.200、0.100、0.020、0.010、0.001 mg/mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾至2 mL進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣，以峰面積（X）對(duì)質(zhì)量濃度（Y）求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.4 樣品測(cè)定

將處理后的樣品提取液進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣量為10 μL，采用外標(biāo)法定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 16.0、Microcal Origin 7.5等軟件進(jìn)行圖表的繪制和相關(guān)數(shù)據(jù)的處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)酸測(cè)定色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相pH值對(duì)有機(jī)酸保留時(shí)間的影響

設(shè)置流速為0.8 mL/min、柱溫30 ℃，以0.01 mol/L磷酸氫二銨為流動(dòng)相，用1.0 mol/L磷酸調(diào)節(jié)pH值，考察不同pH值（2.1、2.3、2.5、2.7、2.9）條件下有機(jī)酸的分離情況，如圖1所示。

圖1 流動(dòng)相pH值對(duì)有機(jī)酸保留時(shí)間的影響Fig.1 Effect of mobile phase pH on the retention times of organic acids

由圖1可知，琥珀酸、檸檬酸的保留時(shí)間隨pH值的增大而呈下降趨勢(shì)，乳酸呈升高趨勢(shì)，而醋酸、蘋(píng)果酸、酒石酸則基本保持不變；pH值較低，6 種酸的峰總體分離度較好，然而出峰時(shí)間較長(zhǎng)，隨著pH值增高，6 種酸的出峰時(shí)間總體縮短，但分離效果卻越來(lái)越差。pH值為2.1和2.3時(shí)盡管6 種酸的分離度均較好，但由于出峰時(shí)間較長(zhǎng)加之pH值過(guò)低容易對(duì)色譜柱造成影響，故綜合考慮，當(dāng)使用pH值為2.5的0.01 mol/L磷酸氫二銨作為流動(dòng)相時(shí)，6 種有機(jī)酸的分離效果較好。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與譚麗賢[21]采用固相萃取-HPLC法測(cè)定醬油中有機(jī)酸的最佳優(yōu)化條件基本一致。

2.1.2 流速對(duì)有機(jī)酸保留時(shí)間的影響

設(shè)定柱溫30 ℃，以0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液（固定pH 2.5）為流動(dòng)相，考察流速分別為0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mL/min時(shí)6 種有機(jī)酸的分離情況，如圖2所示。

圖2 流速對(duì)有機(jī)酸保留時(shí)間的影響Fig.2 Effect of flow rate on the retention times of organic acids

由圖2可知，當(dāng)流速為0.5 mL/min時(shí)，6 種酸的出峰時(shí)間間距加大，有利于峰的分離，但保留時(shí)間整體靠后，導(dǎo)致分析時(shí)間延長(zhǎng)，且各峰出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象；隨著流速的增大，分析時(shí)間明顯縮短，然而6 種酸的分離程度卻越來(lái)越差，且柱壓升高不利于色譜柱的保護(hù)與長(zhǎng)期使用。當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)，醋酸、乳酸兩者的峰形開(kāi)始出現(xiàn)重疊，影響了分離效果。綜合分離效果及分析效率，最終確定0.6 mL/min的流速進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 柱溫對(duì)有機(jī)酸保留時(shí)間的影響

以0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液（用1.0 mol/L磷酸調(diào)節(jié)pH 2.5）為流動(dòng)相，固定流速0.6 mL/min不變，在25、30、35、40、45 ℃ 5 個(gè)柱溫條件下分別進(jìn)行測(cè)定，如圖3所示。

圖3 柱溫對(duì)有機(jī)酸保留時(shí)間的影響Fig.3 Effect of column temperature on the retention times of organic acids

由圖3可知，柱溫對(duì)琥珀酸及檸檬酸的影響較大；隨著柱溫的升高，各有機(jī)酸組分的出峰時(shí)間均提前，除乳酸和醋酸的分離度越來(lái)越高外，其余各種酸的分離度均越來(lái)越低。40 ℃時(shí)6 種酸的分離程度已不及35 ℃時(shí)，25 ℃時(shí)醋酸、乳酸、蘋(píng)果酸三者的分離度不高且分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，30 ℃和35 ℃條件下各種酸的分離度最好，然而考慮到溫度過(guò)高會(huì)對(duì)有機(jī)酸的揮發(fā)產(chǎn)生影響，故選擇30 ℃作為最佳的柱溫條件。江勇等[22]采用HPLC法測(cè)定醬油中的有機(jī)酸，優(yōu)化后固定柱溫為30 ℃進(jìn)行測(cè)定，與本實(shí)驗(yàn)柱溫優(yōu)化結(jié)果相一致（圖4）。

圖4 有機(jī)酸混合標(biāo)樣的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of organic acid standards

2.2 線性范圍

將質(zhì)量濃度在0.001～1.0 mg/mL范圍內(nèi)的系列混標(biāo)溶液進(jìn)行HPLC分析，對(duì)各測(cè)得值進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析和線性回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明：6 種酸的相關(guān)系數(shù)（R2）都為0.999 9，說(shuō)明各種有機(jī)酸組分的峰面積和有機(jī)酸組分質(zhì)量濃度的線性相關(guān)性很好，在此條件下可以很好地測(cè)定有機(jī)酸的含量。當(dāng)信噪比為3時(shí)，6 種有機(jī)酸的檢測(cè)限結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 有機(jī)酸測(cè)定的線性相關(guān)性Table1 Linear equations with correlation coefficients and linear ranges, and limits of detection for six organic acids

2.3 精密度

將0.2 mg/mL的混標(biāo)連續(xù)進(jìn)樣5 次，根據(jù)所得峰面積分別計(jì)算精密度，酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）范圍在0.07%～0.36%之間，表明該方法的精密度良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 方法的精密度實(shí)驗(yàn)（n=5）Table2 Results of precision experiments (n=5)

2.4 重復(fù)性

精密稱取同一份均勻混合的豆豉樣品5 份，按1.3.2節(jié)方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)得酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸的平均含量為4.940、9.165、13.169、8.406、10.100、18.484 mg/g，RSD分別為0.97%、0.98%、1.23%、2.66%、3.04%、1.76%，均在5%以內(nèi)，表明該方法的重復(fù)性均達(dá)到分析的要求，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（n=5）Table3 Results of repeatability experiments (n=5)

2.5 回收率

準(zhǔn)確稱取切細(xì)的2.0 g豆豉，按1.3.2節(jié)方法制備樣品提取液，準(zhǔn)備同一樣品提取液6 份（酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸和琥珀酸的質(zhì)量濃度分別為0.093 4、0.183 8、0.255 6、0.157 8、0.192 4、0.364 0 mg/mL），將不同質(zhì)量濃度的各種有機(jī)酸標(biāo)樣加入至每份提取液中，充分混勻后，使得6 種有機(jī)酸添加的質(zhì)量濃度分別為0.500、0.200、0.200、0.200、0.200、0.500 mg/mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣檢測(cè)，平行測(cè)定6 次，根據(jù)加入的標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度與檢出的質(zhì)量濃度計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，各種有機(jī)酸組分的回收率為94.89%～104.28%，均符合分析方法的要求。

表4 有機(jī)酸測(cè)定的回收率實(shí)驗(yàn)（n=6）Table4 Recovery rates of six organic acids in spiked samples (n=6)

2.6 永川豆豉樣品的測(cè)定

在優(yōu)化的色譜條件下對(duì)永川豆豉樣品進(jìn)行測(cè)定，分析其有機(jī)酸的組成和含量。結(jié)果見(jiàn)表5，色譜圖見(jiàn)圖5。

表5 永川豆豉中各種有機(jī)酸組分含量Table5 Contents of organic acids in Yongchuan douchi

由表5可知，在建立的提取分離條件下，所測(cè)6 種有機(jī)酸中琥珀酸的含量最高，為19.061 mg/g，其次是乳酸，為13.159 mg/g，檸檬酸、蘋(píng)果酸、醋酸3 種有機(jī)酸的含量相近，分別為10.223、9.100、8.382 mg/g，酒石酸含量最低，為4.859 mg/g。這一結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC測(cè)定方法下永川豆豉中的主要有機(jī)酸為琥珀酸和乳酸。熊駿[19]利用紫外-分光光度法對(duì)云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中乳酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸和草酸5 種有機(jī)酸的含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明乳酸的含量最高，而酒石酸含量較低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的相似性。但本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC方法具有能同時(shí)測(cè)定樣品中6 種有機(jī)酸，且測(cè)定時(shí)間較短等優(yōu)點(diǎn)，是一種能夠應(yīng)用于豆豉中有機(jī)酸測(cè)定的快速檢測(cè)方法。

圖5 永川豆豉有機(jī)酸的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of organic acids in Yongchuan douchi

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱，通過(guò)色譜條件的優(yōu)化，并經(jīng)過(guò)最低檢測(cè)限、精密度、重復(fù)性、回收率等方法學(xué)的考察，最終建立了一種HPLC同時(shí)測(cè)定永川豆豉中6 種有機(jī)酸的分析方法，該方法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用此方法測(cè)定出永川豆豉中6 種有機(jī)酸的含量大小依次為：琥珀酸＞乳酸＞檸檬酸＞蘋(píng)果酸＞醋酸＞酒石酸。因此，HPLC同時(shí)測(cè)定永川豆豉中6 種有機(jī)酸方法的建立能夠?yàn)槠渌刽杏袡C(jī)酸的分析提供有益參考。

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Determination of Six Organic Acids in Yongchuan Douchi, a Chinese Traditional Fermented Soybean Product, by HPLC

YE Xiu-juan1, ZHENG Jiong1,2,*, SUO Hua-yi1,2, KAN Jian-quan1,2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was established for the simultaneous determination of organic acids in yongchuan douchi, a Chinese traditional fermented soybean product. The optimal chromatographic conditions were determined. An Agilent ZORBAX SB-Aq (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) column was used to separate the organic acids. The mobile phase was a mixture of 0.01 mol/L (NH4)2HPO4(pH 2.5) and methanol solution at a flow rate of 0.6 mL/min. The column temperature and UV detection wavelength were set as 30 ℃ and 220 nm, respectively. The six organic acids were successfully separated and determined under the chosen experimental conditions. The calibration curves for all these organic acids displayed a good linear relationship with correlation coefficients above 0.999 9 and precision relative standard deviations (RSDs) of 0.07%-0.36% (n = 5) and repeatability RSD of 0.97%-3.04% (n = 5). The recovery rates of the six organic acids were in the range of 94.89%-104.28%. The method is convenient, rapid, accurate, reproducible and applicable to determine organic acids in yongchuan douchi.

yongchuan douchi; high performance liquid chromatographic (HPLC); organic acid; determination

TS207.3

A

1002-6630（2014）20-0114-05

10.7506/spkx1002-6630-201420023

2014-01-17

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201411）

葉秀娟（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：yexiujuan127@gmail.com

*通信作者：鄭炯（1982—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)、果蔬加工。E-mail：zhengjiong_swu@126.com