Cyclin D1調(diào)控U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期研究

[摘要] 目的 探討細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1，CCND1）在U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期調(diào)控中的作用。 方法 根據(jù)NCBI GenBank中cyclin D1序列設(shè)計雙鏈siRNA，利用Western blotting技術(shù)驗證設(shè)計的siRNA序列的有效性，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測抑制CCND1對U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期進程的影響。 結(jié)果 經(jīng)Western blotting檢測，成功抑制了CCND1的表達(dá)。并且抑制CCND1后，U87細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制了U87細(xì)胞的G1/S期轉(zhuǎn)換。 結(jié)論 U87細(xì)胞中抑制CCND1可以顯著抑制細(xì)胞周期進程，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，為進一步研究膠質(zhì)瘤的靶向治療奠定了理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] Cyclin D1；U87；細(xì)胞周期

[中圖分類號] R739.41 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）15-0008-02

人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，約占成人顱內(nèi)腫瘤的40%～50%[1]，通過傳統(tǒng)的手術(shù)、化療及放療等治療預(yù)后極差[2]。細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程，目前的研究表明腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞周期分子調(diào)控的異常密切相關(guān)。細(xì)胞周期蛋白D家族（Cyclin D）包括Cyclin D1（CCND1）、Cyclin D2和Cyclin D3，其中Cyclin D1與腫瘤周期調(diào)控密切相關(guān)[3-5]。大量研究證實，膠質(zhì)瘤中存在Cyclin D1過表達(dá)，并且其表達(dá)程度與腫瘤惡性程度和患者預(yù)后相關(guān)[6-10]。然而，Cyclin D1在膠質(zhì)瘤中是否調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期進程報道較少。因此，確定Cyclin D1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的調(diào)控機制，有助于進一步研究以Cyclin D1為靶點的藥物對膠質(zhì)瘤進行治療。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87，貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%～90%融合后傳代培養(yǎng)，取3～8代處于指數(shù)生長期的細(xì)胞進行試驗。

1.2 試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司）；cyclin D1 siRNA由上海吉瑪公司合成；CCND1一抗（Santa Cruz，美國）；Nocodazole（Sigma公司）。CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；倒置顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染處理 取指數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，3×105個細(xì)胞/孔，分為正常生長組、空白對照組和siRNA組。24 h以后對細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，具體實驗方案參考LipofectaminTM 2000產(chǎn)品使用說明書。細(xì)胞接種24 h后吸取培養(yǎng)基，加入無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基2 mL。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，溶液A：250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基+5 μL LipofectaminTM 2000，溶液B：250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基+50 μmol/L siRNA，室溫下分別靜置5 min。然后將溶液A與溶液B混合，室溫靜置20 min后加入細(xì)胞中。放入CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，6 h后換成含血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基。

1.3.2 蛋白免疫印跡 轉(zhuǎn)染siRNA后48 h的U87細(xì)胞用RIPA裂解蛋白，并用BCA法檢測蛋白濃度。每組取60 μg總蛋白行SDS-PAGE，250 V轉(zhuǎn)PVDF膜90 min后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4℃一抗封閉過夜，TBST洗滌10 min×3次，然后將HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，再次TBST洗滌10 min×3次后ECL法發(fā)光，暗室曝光、顯影、洗片。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 在轉(zhuǎn)染siRNA后24 h的U87細(xì)胞中加入100 ng/mL Nocodazol將細(xì)胞周期同步化；繼續(xù)培養(yǎng)20 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞，500 g離心5 min收集細(xì)胞，1×PBS洗兩次；加入冰冷的NP40/PI染液及25 mg/mL RNase A，37℃水浴30 min；通過300目篩網(wǎng)過濾入流式管中，上機檢測。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析 細(xì)胞周期分布用Modfit 3.0軟件（Verity Software House，Topsham，ME，USA）分析。實驗采用三次獨立實驗結(jié)果數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，所得數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，在進行兩組之間的差異分析時選用雙尾Student’s t-test。P < 0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 驗證設(shè)計的siRNA序列的有效性

參照NCBI GenBank中人類cyclin D1 cDNA序列設(shè)計siRNA序列，由上海吉瑪生物制藥有限公司合成。對U87細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，收取蛋白進行免疫印跡檢測。如圖1所示，設(shè)計的siRNA可以有效抑制cyclin D1的表達(dá)。上游序列：5'-GGAGAACAAACAGAUCAUCdTdT-3'。下游序列：5'-GAUGAUCUGUUUGUUCUCCdTdT-3'。

2.2 Cyclin D1對U87細(xì)胞周期的影響

我們對轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入100 ng/mL Nocodazole使細(xì)胞周期同步在G2期，檢測Cyclin D1對U87細(xì)胞周期的影響。從結(jié)果可以看出（圖2），在U87細(xì)胞中抑制Cyclin D1可以使處于G1期的細(xì)胞增加49.80%。由此可見，過表達(dá)抑制Cyclin D1可以使細(xì)胞阻滯在G1期，抑制了細(xì)胞從G1期至S期的轉(zhuǎn)換。

3 討論

近年來的分子生物學(xué)研究表明，腫瘤的形成是細(xì)胞無限增殖的結(jié)果，在這一過程中多種與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的功能喪失，使腫瘤細(xì)胞增殖周期發(fā)生異常[11]。G1期細(xì)胞周期調(diào)控失常與膠質(zhì)瘤的發(fā)生密切相關(guān)[12]。Cyclin D1是重要的G1期調(diào)控因子，研究表明其與膠質(zhì)瘤的發(fā)生及預(yù)后具有相關(guān)性，但是其在膠質(zhì)瘤中的作用到底如何研究較少。本研究明確指出，Cyclin D1在U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中可以顯著抑制細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換，使細(xì)胞阻滯在G1期。

細(xì)胞在顱內(nèi)生長環(huán)境復(fù)雜，并且調(diào)控著人體的行為方式。膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，膠質(zhì)瘤細(xì)胞來源廣泛，許多腫瘤不止包括一種發(fā)病細(xì)胞。并且生長速度較快，常沿著周圍組織和神經(jīng)纖維浸潤性生長。目前外科手術(shù)難以徹底切除腫瘤，又極易造成行為功能損害，并且術(shù)后放化療的效果不夠理想。因此，對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療是十分困難的。如何有效地治療膠質(zhì)瘤及改善預(yù)后成為目前臨床關(guān)注的一個焦點。基因治療是目前治療腫瘤的最新治療方法，基于抑制Cyclin D1在膠質(zhì)瘤中可以使細(xì)胞周期停滯在G1期，隨著研究的深入和逐漸應(yīng)用于臨床，可以預(yù)料運用Cyclin D1作為藥物靶點必將成為未來治療膠質(zhì)瘤的有效手段之一，有著較為廣泛的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2013-04-03）