微囊化成骨細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化的量效研究

[摘要] 目的 探討微囊化成骨細(xì)胞體系細(xì)胞添加量對(duì)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化的影響。 方法 制備含有成骨細(xì)胞的海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊，與間充質(zhì)干細(xì)胞的共培養(yǎng)，在1，7，14 d通過細(xì)胞增殖量、堿性磷酸酶活性、實(shí)時(shí)定量PCR等檢測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并分析。 結(jié)果 各時(shí)段細(xì)胞增量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；堿性磷酸酶活性隨細(xì)胞濃度增加表現(xiàn)出遞增趨勢，且骨鈣蛋白mRNA的表達(dá)結(jié)果基本一致。 結(jié)論 微囊化成骨細(xì)胞在低濃度下已能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，濃度升高時(shí)促分化能力越強(qiáng)，但達(dá)到一定濃度后繼續(xù)提高時(shí)，對(duì)成骨分化的作用則不再增強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞] 微囊；成骨細(xì)胞；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；分化

[中圖分類號(hào)] R73 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）15-0004-01

骨缺損和骨折不愈合是骨科醫(yī)生常面臨的困難，骨組織工程為解決這一問題帶來了希望。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal cells，BMSCs）作為骨組織工程的種子細(xì)胞已獲得了廣泛的認(rèn)同[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多方向分化潛能的干細(xì)胞[2]，目前的研究表明BMSCs能夠分化為成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，不表達(dá)共刺激抗原，是一種理想的種子細(xì)胞，可以修復(fù)受損的人體組織，在組織工程和整形外科等領(lǐng)域具有重要的研究價(jià)值[3]。由于人體組織器官結(jié)構(gòu)功能的復(fù)雜性，干細(xì)胞在植入人體前應(yīng)進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化，從而降低臨床應(yīng)用的危險(xiǎn)性[4]。基于上述前提，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定

新生SD大鼠處死后，在無菌條件下，取顱蓋骨，去除軟組織，將骨塊剪成1～2 mm2大小后PBS溶液反復(fù)洗滌，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，加入5 mL胰蛋白酶溶液（濃度為0.25%），37℃ 15 min水浴振蕩消化后加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，加入3 mL Ⅱ型膠原酶溶液（濃度1 mg/mL），在37℃水浴消化90 min，離心后除去上清液。加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液后，用吸管輕輕打散細(xì)胞沉淀，制成細(xì)胞懸液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)于37°C，5%體積分?jǐn)?shù)CO2環(huán)境中培養(yǎng)。48 h全量換液繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換1次液，待細(xì)胞融合到80%時(shí)，吸去培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次后用1 mL含有0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化，加入培養(yǎng)液終止消化，離心加培養(yǎng)液重懸之后，采用差速貼壁法篩選獲取純化的成骨細(xì)胞原代。待細(xì)胞集落呈70%～80%匯合時(shí)開始傳代，傳代3次后進(jìn)行堿性磷酸酶染色鑒定。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及免疫表型、成骨分化潛能的鑒定

采用全骨髓貼壁法分離BMSCs：SD大鼠麻醉后常規(guī)消毒，備皮，左側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子處作骨髓穿刺術(shù)。抽取3 mL左右骨髓置于離心管，PBS沖洗，離心（1000轉(zhuǎn)/10 min）后棄上清和脂肪，洗滌2次后加入含有標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37°C，5%體積分?jǐn)?shù)CO2環(huán)境中培養(yǎng)。48 h后換液，以PBS洗滌2次，換上新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液一次，待到細(xì)胞集落呈70%～80%匯合時(shí)，開始傳代。

BMSCs的成骨分化潛能的鑒定：取第3代BMSCs接種于放有細(xì)胞爬片的6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞覆蓋達(dá)80%，棄去普通培養(yǎng)液，加入含成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液，每3天換液一次，培養(yǎng)2周。成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑含β-甘油磷酸鈉10 mM，地塞米松10-9 M，抗壞血酸鈉0.2 mM，F(xiàn)BS。經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后取出細(xì)胞爬片進(jìn)行堿性磷酸酶染色鑒定。

1.3 微囊化成骨細(xì)胞（OB-APA微囊）的制備和培養(yǎng)以及形態(tài)學(xué)觀察

1.3.1 微囊化成骨細(xì)胞的制備和培養(yǎng) 靜電液滴發(fā)生法制備OB-APA微囊：將成骨細(xì)胞與15 g/L的海藻酸鈉溶液以體積比1∶10混合均勻，吸入20 mL注射器，在最優(yōu)制備條件下混入0.1 mol/L CaCl2，海藻酸鈣微球，靜置10 min后除去上清液，生理鹽水洗滌3次，將膠珠投入0.5%聚左賴氨酸震蕩條件下反應(yīng)5 min，生理鹽水洗滌3次，再用1.5 g/L的海藻酸鈉溶液振蕩5 min，除去上清液并用生理鹽水洗滌3次，再投入55 mmol/L檸檬酸鈉液化5 min，生理鹽水洗滌，即得OB-APA微囊[5]。

1.3.2 微囊化成骨細(xì)胞計(jì)數(shù) 采用機(jī)械破囊計(jì)數(shù)法測定制備的OB-APA微囊中的成骨細(xì)胞的量，即采用1 mL無菌注射器，內(nèi)徑約為330 nm 的3號(hào)針頭反復(fù)抽吸微囊懸液，使微囊破碎。顯微鏡下觀察以確定細(xì)胞已完全釋放，然后采用200目篩網(wǎng)過濾微囊碎片，離心，重懸細(xì)胞，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.3.3 微囊化成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及形態(tài)學(xué)觀察 制得的微囊化成骨細(xì)胞置于培養(yǎng)皿內(nèi)，使其分散均勻，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)

將第3代BMSCs 接種于放有爬片的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為5×106 cells/cm2的密度，加入微囊化成骨細(xì)胞，及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。根據(jù)成骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的添加量的比值進(jìn)行分組。A組：15∶1；B組：10∶1；C組：5∶1；D組：1∶1。

1.5 共培養(yǎng)后BMSCs向成骨細(xì)胞定向分化的生物學(xué)檢測

1.5.1 通過測定DNA含量變化分析BMSCs增殖情況 培養(yǎng)的1、7和14 d，每組取出3個(gè)樣本，PBS液沖洗后0℃下在含有EDTA和巰基乙醇的細(xì)胞裂解液中消化30 min。得上清液，超聲儀高頻聲波裂解，4℃離心（12 000轉(zhuǎn)/5 min）。取40 μL的細(xì)胞裂解上清液與160 μL的Hoechst 33258染液混合（1 μg/mL）通過稀釋1 mg/mL的牛胸腺DNA獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線測得DNA的含量，并通過熒光計(jì)測量每個(gè)樣品的熒光強(qiáng)度。

1.5.2 堿性磷酸酶活力檢測 在共培養(yǎng)的第1、7和14天，每組取出3個(gè)樣本，PBS液沖洗后，0℃下在含有EDTA和巰基乙醇的細(xì)胞裂解液中消化30 min。離心，得上清液，超聲儀高頻聲波裂解，4℃離心（12 000轉(zhuǎn)/5 min）。取100 μL上清液并與400 μL的P-硝基苯磷酸混合，37℃下孵育15 min后50 μL NaOH終止反應(yīng)。紫外分光光度計(jì)在450 nm波長下測定吸光度。

1.5.3 實(shí)時(shí)定量PCR 骨鈣蛋白是檢測成骨細(xì)胞成熟分化的標(biāo)志物。各實(shí)驗(yàn)組分別在培養(yǎng)第1、7和14天進(jìn)行RT-PCR檢測。引物序列如下。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用IBM SPSS17.0軟件，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析。P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生長情況及ALP染色倒置顯微鏡下觀察BMSCs呈梭形和紡錘形；OB呈卵圓形，培養(yǎng)瓶中可見典型的鋪路石樣。倒置顯微鏡下可見骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力良好。

2.2 OB-APA的形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察到微囊完整性好，不粘連，表面光滑，微球粒徑分布也較為均勻。

2.3 BMSCs的增殖情況檢測

各試驗(yàn)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖量基本相同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.4 BMSCs的分化情況檢測

2.4.1 ALP活性檢測結(jié)果 在兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的第1天，各實(shí)驗(yàn)組的堿性磷酸酶基本沒有區(qū)別（P > 0.05）；在共培養(yǎng)第7天和第14天，A組與B組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性較C組與D組高（P < 0.01，P < 0.05），C組的堿性磷酸酶活性較D組高（P < 0.05），且在第7天和第14天，A組與B組的堿性磷酸酶活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.4.2 RT-PCR檢測Osteocalcin（OCN） mRNA的表達(dá) 骨鈣蛋白是成骨細(xì)胞的表型之一，且被認(rèn)為是成骨細(xì)胞成熟分化的重要標(biāo)志。在兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的第1天，各實(shí)驗(yàn)組的OCN mRNA的表達(dá)情況沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；在共培養(yǎng)7 d后，A組與B組細(xì)胞的OCN mRNA的表達(dá)情況較C組與D組高（P < 0.05），C組的OCN mRNA的表達(dá)情況較D組高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），且在第7天和第14天，A組與B組的堿性磷酸酶活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

3 討論

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化能力，取材廣泛，能在各自特定的條件下分化為成骨細(xì)胞[6]，具有典型干細(xì)胞的特點(diǎn)[7-8]。BMSC不僅具有較強(qiáng)的增殖能力，而且隨機(jī)體衰老，其仍能保持良好的干細(xì)胞特征。體外傳代12代以上仍能保持正常的染色體組型和端粒酶活性，也就是在體外傳代過程中可以維持其干細(xì)胞特性[9]。

成骨細(xì)胞具有分泌作用，可分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白[10]，堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子[11]、胰島素樣生長因子[12]等。研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白在體外培養(yǎng)下可以促進(jìn)BMSCs成骨分化[13-14]，且BMP具有跨種誘導(dǎo)成骨的能力[15]。血小板衍生因子是刺激骨髓基質(zhì)干細(xì)胞有絲分裂和遷移最重要的因素[16-17]。

微囊技術(shù)[5]，即以海藻酸鈉和聚賴氨酸為材料，制備APA微囊，將分泌生長因子的細(xì)胞包裹在微囊內(nèi)，與目的細(xì)胞共培養(yǎng)，當(dāng)微囊在細(xì)胞分泌生長因子的條件下，使靶細(xì)胞定向分化。微球囊的成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)后，在微球囊的成骨細(xì)胞分泌的多種生長因子作用下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于體外定向分化為成骨細(xì)胞，共培養(yǎng)后微球囊包裹的成骨細(xì)胞可以完全去除，達(dá)到非接觸共培養(yǎng)的目的。已有研究表明微囊化成骨細(xì)胞具有促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的能力[18]，但是微囊化成骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的量效關(guān)系尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)首先探討了微囊化成骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)不同添加比例對(duì)BMSCs成骨分化的影響影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，微囊化成骨細(xì)胞的添加濃度對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；添加的微囊化成骨細(xì)胞在1∶1濃度下已能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，且隨著添加濃度的升高，促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化的能力越強(qiáng)，但是在濃度達(dá)到10∶1之后提高濃度對(duì)促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化的作用沒有增強(qiáng)，并且證實(shí)10∶1的微囊化成骨細(xì)胞對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖達(dá)到最大的量效。

本研究的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞基于靜態(tài)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，而體內(nèi)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞處于相對(duì)動(dòng)態(tài)環(huán)境。在上述研究的基礎(chǔ)上有必要進(jìn)一步的深入研究，全面比較體外共培養(yǎng)時(shí)力學(xué)刺激因素能否促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成熟分化，且加入力學(xué)刺激因素后需求的微囊化成骨細(xì)胞的量效關(guān)系。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Minguell JJ，Erices A，Conget P. Mesenchymal stem cells[J]. Exp Biol Med （Maywood），2001，226（6）：507-520.

[2] Musina RA，Bekchanova ES，Belyavskii AV，et al. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin[J]. Bull Exp Biol Med，2006，141（1）：147-151.

[3] Jiang Y，Jahagirdar BN. Reinhardt RL. Pluripoteney of mesenchymal stem cells derived from adult marrow[J]. Nature，2002，418（4）：41-49.

[4] LI X，Yu X，Lin Q，et al. Bone marrow mesenehymal steme cells differentiate into functional cardic phenotypes by cardiac micro environment[J]. J Mol Cell Cardiol，2007，42（2）：295-303.

[5] 徐艷艷，傅紅興，趙應(yīng)征，等. 載紅細(xì)胞海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，40（5）：465-468.

[6] Wadagaki R，Mizuno D，Yamawaki-Ogata A，et al. Osteogenic induction of bone marrow-derived stromal cells on simvastatin-releasing，biodegradable，nano-to microscale fiber scaffolds[J]. Ann Biomed Eng，2011，39（7）：1872-1881.

[7] Park Y J，Lee Y M，Park S N，et al. Platelet derived growth factor releasing chitosan sponge for poriodontal bone regeneration[J]. Biomaterials，2000，21（2）：153-159.

[8] Anselme K. Osteoblast adhesion on biomaterials[J]. Biomaterials，2000， 21（7）：667-672.

[9] Charbord P. Bone marrow mesenchymal stem cells：historical overview and concepts[J]. Hum Gene Ther，2010，21（9）：1045-1056.

[10] Wada Y，Kataoka H，Yokoes S，et al. Changes in osteoblast phenotype during differentiation of enzymatieally isolated rat calvaria cells[J].Bone，1998，22（5）：479-485.

[11] Yang D，Chen J，Jing Z，et al. Platelet-derived growth factor（PDGF）-AA：a self-imposed cytokine in the proliferation of human fetal osteoblasts[J]. Cytokine，2000，12（8）：1271-1274.

[12] Baylink J，F(xiàn)inkelman RD，Mohan S. Growth factors to srimulate bone formation[J]. J Bone Miner Res，1993，8（2）：S565-572.

[13] Hanada K，Dennis JE，Caplan AI. Stimulatory effects of basic fibroblast growth factor and bone morphogenetic protein-2 on osteogenic differentiation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].J Bone Miner Res，1997，12（10）：1606-1614.

[14] Ikeuchi M，Dohi Y，Horiuchi K，et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 promotes osteogenesis within atelopeptide type I collagen solution by combination with rat cultured marrow cells[J]. J Biomed Mater Res，2002，60（1）：61-69.

[15] Anitua E，Andia I，Sanchez M，et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture[J]. J Orthop Res，2005，23（2）：281-286.

[16] Gruber RF，Karreth B，Kandler，et al. Platelet-released supernatants increase migration and proliferation，and decrease osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells under in vitro conditions[J]. Platelets，2004（15）：29-35.

[17] Bouletreau PJ，Warren SM，Spector JA，et al. Factors in the fracture microenvironment induce primary osteoblast angiogenic cytokine production[J]. Plast Reconstr Surg，2002（110）：139-148.

[18] 劉洋，于濱濱，王為，等. 微囊化共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向成骨分化研究[J]. 高校化學(xué)工程學(xué)報(bào)，2010，24（6）：993-999.

（收稿日期：2013-03-15）