嚴(yán)重?zé)齻摱景Y患者骨骼肌蛋白降解變化機(jī)制研究

[摘要] 目的 研究嚴(yán)重?zé)齻摱景Y患者骨骼肌蛋白降解變化及機(jī)制。 方法 2012年1～6月收集嚴(yán)重?zé)齻槟摱景Y患者8例為膿毒癥組。同時(shí)選擇整形患者10例作為對(duì)照。檢測(cè)對(duì)照組及膿毒癥組傷后3、5、7、14、21 d血清中腫瘤壞死因子-α、皮質(zhì)醇、尿液中3-甲基組氨酸的含量，以及股四頭肌中泛素基因表達(dá)和蛋白表達(dá)。 結(jié)果 膿毒癥組燒傷后3、5、7、14、21 d各指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。膿毒癥組皮質(zhì)醇、TNF-α、3-MH在燒傷后逐漸升高，7 d時(shí)達(dá)到高峰，后逐漸下降，但在21 d時(shí)仍然高于對(duì)照組。尿內(nèi)3-MH的排泄量與血TNF-α和皮質(zhì)素水平的變化呈正相關(guān)，r = 0.89、0.91，P < 0.01。膿毒癥組股四頭肌組織內(nèi)泛素mRNA、E2-14k mRNA、C2亞基的mRNA、蛋白酶體C2亞基蛋白的表達(dá)較對(duì)照組均顯著增加。 結(jié)論 嚴(yán)重?zé)齻摱景Y患者出現(xiàn)骨骼肌降解，與皮質(zhì)醇、TNF-α升高有一定的關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 燒傷；膿毒癥；骨骼?。坏鞍?/p>

[中圖分類號(hào)] R644 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）13-0018-03

膿毒癥是重癥燒傷常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，常常發(fā)病急，進(jìn)展快，并發(fā)器官功能衰竭，如果治療不及時(shí)，患者病死率較高[1]。因此，嚴(yán)重?zé)齻摱景Y的救治一直是國(guó)內(nèi)外燒傷醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)、重點(diǎn)和亟待解決的重大疑難問(wèn)題。燒傷膿毒癥時(shí)患者骨骼肌蛋白出現(xiàn)高分解代謝，導(dǎo)致負(fù)擔(dān)平衡[2]。目前關(guān)于燒傷膿毒癥時(shí)骨胳肌蛋白高分解代謝的機(jī)制尚不完全明了。在膿毒癥時(shí)，蛋白高分解代謝呈現(xiàn)“強(qiáng)制性”的特點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白分解、糖和脂肪的利用率下降，機(jī)體負(fù)擔(dān)平衡，營(yíng)養(yǎng)不良，最終導(dǎo)致多種并發(fā)癥的發(fā)生。骨骼肌約占機(jī)體細(xì)胞總量的50%，在蛋白分解代謝、負(fù)氮平衡中有重要的意義。本文的目的是探討燒傷膿毒癥患者骨骼肌蛋白降解變化及機(jī)制，為臨床上預(yù)防和控制蛋白的高代謝提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1～6月在我院進(jìn)行治療的嚴(yán)重?zé)齻槟摱景Y患者8例為膿毒癥組，其中男6例，女2例，年齡18～47歲，平均（38.1±13.2）歲。平均燒傷面積（68.3±17.5）%，平均Ⅲ度燒傷面積達(dá)（46.8±14.9）%。所有患者均符合燒傷膿毒癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。選擇同期住院行整形手術(shù)的患者10例為對(duì)照組，其中男7例，女3例，年齡23～45歲，平均（36.2±14.8）歲。兩組性別比、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），有可比性。所有入組患者均知情同意。

1.2 標(biāo)本采集

收集對(duì)照組和膿毒癥組傷后3 d、5 d、7 d、14 d、21 d的靜脈血標(biāo)本及24 h的尿標(biāo)本。所有燒傷患者在切燒傷痂時(shí)順肌纖維方向切取肱二頭肌和股四頭肌標(biāo)本，對(duì)照組在整形瘢痕切除術(shù)時(shí)切取股四頭肌標(biāo)本。所有標(biāo)本分為兩部分，一部分采用甲醛固定，一部分置液氮保存。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 血標(biāo)本 采集的靜脈血標(biāo)本靜置分層，離心，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。血漿皮質(zhì)醇和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒由上海撫生實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.3.2 尿標(biāo)本 采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定尿中3-甲基組氨酸。試劑由美國(guó)Sigma公司提供。

1.3.3 骨骼肌 ①泛素系統(tǒng)基因表達(dá)：一步法提取組織中的總的RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，引物由賽百盛生物工程技術(shù)公司提供。每份RNA中去30 μg進(jìn)行變性、電泳及轉(zhuǎn)膜，在膜上標(biāo)記28S rRNA條帶和18S rRNA條帶。然后將膜放入預(yù)雜交液，65℃，共5 h。將cDNA探針加入雜交A液內(nèi)變性處理，冷卻后加入雜交B液中，65℃預(yù)熱。棄預(yù)雜交液，在加入雜交液，過(guò)夜。室溫洗膜，然后60℃洗膜15 min，2遍。濾紙吸干，-65℃放置24 h，自顯影。②泛素蛋白表達(dá)：骨骼肌組織石蠟包埋、切片，層厚4 μm，化臘、脫蠟。蒸餾水沖洗，浸泡于過(guò)氧化物中，取出過(guò)氧化物酶。PBS緩沖液沖洗3次，枸櫞酸鹽緩沖液中95℃，10 min，進(jìn)行熱修復(fù)。分別采用正漏水和PBS液清洗，封閉5 min，加兔抗鼠泛素抗體，37℃ 2 h，PBS液清洗3次，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗，37℃作用1 h，PBS液沖洗3次，顯色，甲基綠復(fù)染，乙醇脫水，封片，觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用方差分析和t檢驗(yàn)，3-甲基組氨酸與皮質(zhì)醇和腫瘤壞死因子-α水平的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)醇、TNF-α、3-甲基組氨酸結(jié)果

見表1和圖1～3。膿毒癥組燒傷后3、5、7、14、21 d各指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。膿毒癥組皮質(zhì)醇、TNF-α、3-MH在燒傷后逐漸升高，在7 d時(shí)達(dá)到高峰，后逐漸下降，但在21 d時(shí)仍然高于對(duì)照組。

2.2 尿內(nèi)3-MH的排泄量與血TNF-α和皮質(zhì)素水平的相關(guān)性

尿內(nèi)3-MH的排泄量與血TNF-α和皮質(zhì)素水平的變化呈正相關(guān)，r = 0.89、0.91，P < 0.01。

2.3 泛素基因表達(dá)和蛋白的表達(dá)

膿毒癥組股四頭肌組織內(nèi)泛素mRNA的表達(dá)2.4 kb和1.2 kb的表達(dá)較對(duì)照組均顯著增加。見圖4。膿毒癥患者E2-14k mRNA的表達(dá)顯著強(qiáng)于對(duì)照組。見圖5。膿毒癥組C2亞基的mRNA表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組。見圖6。蛋白酶體C2亞基蛋白的表達(dá)見圖7，膿毒癥組顯著強(qiáng)于對(duì)照組。

3 討論

膿毒癥是嚴(yán)重?zé)齻颊叩某Ｒ姴l(fā)癥，患者往往起病急、進(jìn)展快，嚴(yán)重者可導(dǎo)致多器官功能障礙，甚至危及生命[4]?；颊咧饕憩F(xiàn)為精神興奮、多語(yǔ)、譫妄等異常，體溫驟升至39.5℃以上或劇降至正常以下，呼吸>35次/min，心率>140次/min，腹脹、腸鳴音減弱或消失，創(chuàng)面急劇惡化，出現(xiàn)膿毒性休克時(shí)出現(xiàn)少尿。1905年Sneve提出嚴(yán)重?zé)齻颊叽嬖诟叽x情況，表現(xiàn)為明顯的疲乏、虛弱、消瘦。在燒傷早期，骨骼肌處于高分解代謝狀態(tài)，這種分解代謝有利于機(jī)體的自我保護(hù)，為肝臟合成急性期蛋白提供游離氨基酸，為免疫系統(tǒng)及腸上皮細(xì)胞提供谷氨酸。但大量肌纖維蛋白的分解，造成負(fù)氮平衡，長(zhǎng)期下去導(dǎo)致患者抵抗力下降，影響預(yù)后[5]。

泛素（ubiquitin）是一種存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中的小蛋白。它的主要功能是標(biāo)記需要分解掉的蛋白質(zhì)，使其被水解[6]。當(dāng)附有泛素的蛋白質(zhì)移動(dòng)到桶狀的蛋白酶的時(shí)候，蛋白酶就會(huì)將該蛋白質(zhì)水解。泛素相關(guān)酶催化的一系列反應(yīng)發(fā)生的整個(gè)過(guò)程被稱為泛素化信號(hào)通路。泛素蛋白降解的途徑在骨骼肌代謝中具有重要的意義。泛素化系統(tǒng)主要有三部分，包括蛋白酶體、泛素、泛素相關(guān)酶。泛素相關(guān)酶包括泛素活化酶、泛素偶聯(lián)酶、泛素連接酶、泛素鏈延長(zhǎng)酶及去泛素化酶[7]。其中E2-14k酶與骨骼肌的分解代謝具有密切的關(guān)系。C2亞基是蛋白降解的中心結(jié)構(gòu)。本研究顯示，膿毒癥患者泛素 mRNA、E2-14k、C2亞基mRNA的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明膿毒癥患者存在明顯的骨骼肌分解代謝。

3-甲基組氨酸是1-甲基組氨酸的同分異構(gòu)體，是肌動(dòng)蛋白的一個(gè)組分。1967年Johnson等發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白中均含有3-MH，蛋白結(jié)合狀態(tài)的3-MH主要分布在骨骼肌內(nèi)。3-MH主要通過(guò)尿路排泄。當(dāng)肌肉分解代謝時(shí)，3-MH同其他氨基酸一起釋放入血，然后經(jīng)過(guò)尿排出。因此測(cè)定尿液中3-MH的含量是肌肉蛋白質(zhì)分解代謝的可靠指標(biāo)。本研究結(jié)果也顯示，膿毒癥組尿3-MH顯著高于對(duì)照組，且在燒傷后7 d達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。

TNF-α是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一，屬于炎癥因子，在機(jī)體處于感染的情況下，TNF-α分泌增加。皮質(zhì)醇是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類甾體激素，具有調(diào)節(jié)糖、脂肪、和蛋白質(zhì)的生物合成和代謝的作用，還具有抗炎作用，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，皮質(zhì)醇分泌明顯增多。本文顯示，膿毒癥患者血中TNF-α和皮質(zhì)醇水平均顯著升高，且在7 d時(shí)達(dá)到高峰。而皮質(zhì)醇和TNF水平的增加能夠激活泛素蛋白酶體途徑[8]，促進(jìn)骨骼肌的代謝。尿內(nèi)3-MH的排泄量與血TNF-α和皮質(zhì)素水平的變化呈正相關(guān)，也印證了皮質(zhì)醇和泛素能夠促進(jìn)骨骼肌分解代謝。

綜上所述，燒傷膿毒癥患者存在明顯的骨骼肌分解代謝，其發(fā)生與膿毒癥患者血中TNF-α和皮質(zhì)醇水平升高有一定的關(guān)系。

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（收稿日期：2013-01-25）