大腸埃希菌臨床分離菌株喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥機(jī)制研究

[摘要] 目的 探討我院臨床分離的大腸埃希菌株耐藥基因的分布及其在耐藥中的作用機(jī)制。 方法 選擇我院臨床分離的大腸埃希菌菌株，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行喹諾酮類(lèi)藥物藥敏試驗(yàn)，篩選耐藥菌株并測(cè)定環(huán)丙沙星MIC，對(duì)喹諾酮耐藥菌株進(jìn)行qnrA、qnrB、aac-（6’）-Ib-cr、GyrA及ParC檢測(cè)，并進(jìn)行基因擴(kuò)增測(cè)序。 結(jié)果 84株臨床分離的大腸埃希菌菌株中有24株對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥，耐藥率為28.4%。其中對(duì)2種藥物耐藥4株，對(duì)3種藥物耐藥6株，對(duì)5種藥物耐藥14株。耐藥菌株MIC值為對(duì)照菌株148～596倍，24株耐藥菌中檢出qnrA質(zhì)?；?2株、qnrB質(zhì)?；?株、aac-（6’）-Ib-cr基因4株、GyrA基因喹諾酮決定區(qū)突變11株、ParC基因決定區(qū)突變4株。 結(jié)論 我院存在大腸埃希菌喹諾酮耐藥菌株，且耐藥菌株耐藥機(jī)制復(fù)雜，耐藥基因的產(chǎn)生及酶類(lèi)耐藥突變是主要原因，臨床要加強(qiáng)對(duì)耐藥菌株的檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 大腸埃希菌；喹諾酮；抗生素；耐藥基因

[中圖分類(lèi)號(hào)] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）10-0080-03

大腸桿菌是臨床常見(jiàn)的致病菌，大腸埃希菌是其中最常見(jiàn)的菌屬，伴隨近年來(lái)抗菌藥物的臨床應(yīng)用及抗生素的不斷發(fā)展，大腸埃希菌的耐藥菌株不斷出現(xiàn)，且耐藥性不斷提高，耐藥機(jī)制日趨復(fù)雜，如細(xì)菌酶類(lèi)耐藥突變、耐藥基因的突變表達(dá)等，近年來(lái)質(zhì)粒耐藥機(jī)制相關(guān)的質(zhì)?；蛉鐀nrA、qnrB等成為研究熱點(diǎn)[1，2]，質(zhì)粒具有可轉(zhuǎn)移性，其不僅能夠?qū)е履退幘陮?duì)抗生藥的耐藥，而且能夠引起耐藥性在不同菌株之間的傳遞，導(dǎo)致菌株廣泛耐藥，嚴(yán)重影響臨床治療效果，目前臨床已經(jīng)分離出多個(gè)耐藥基因，本研究就qnrA、qnrB、aac-（6’）-Ib-c等耐藥基因在耐藥性大腸埃希菌的表達(dá)及其作用機(jī)制進(jìn)行研究，為大腸埃希菌耐藥菌株的檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

選擇我院2010年1月～2012年6月臨床分離的非重復(fù)84株大腸埃希菌菌株，分離菌株均經(jīng)VITEK2-compact 微生物鑒定系統(tǒng)鑒定到種，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922菌株，結(jié)合實(shí)驗(yàn)菌株為大腸埃希菌J53 AzR菌株。所有菌株均深低溫保存，臨用前復(fù)蘇。

1.2 主要儀器及試劑

環(huán)丙沙星（CIP）藥敏紙片、左氧氟沙星（LVX）藥敏紙片、諾氟沙星藥敏紙片（NFX）、司帕沙星（SPX）藥敏紙片、氧氟沙星（OFX）藥敏紙片購(gòu)自武漢博士德生物試劑公司，平板瓊脂購(gòu)自浙江碧云天生物試劑公司，肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自南京建成生物工程研究所，Taq、dNTPs、DNA MarkerⅢ及DNA 100 bp Ladder 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Tanon EPS-100型電泳儀購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限公司，VITEK2-compact微生物鑒定系統(tǒng)購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司，梯度 PCR 儀購(gòu)自德國(guó) Eppendorf公司，UVP 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 藥敏實(shí)驗(yàn)及菌株篩選

菌株耐藥性檢測(cè)采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)5種喹諾酮類(lèi)藥物（環(huán)丙沙星藥、左氧氟沙星、諾氟沙星、司帕沙星片、氧氟沙星），藥敏試驗(yàn)結(jié)果參照2009年版CLSI M100-S19規(guī)定執(zhí)行，選擇耐藥菌株培養(yǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 MIC值測(cè)定

抗生素最低抗菌藥物濃度測(cè)定采用微量肉湯稀釋法測(cè)定，測(cè)定藥物選擇環(huán)丙沙星，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922菌株。

1.5 PCR反應(yīng)

采用煮沸法制備模板，印務(wù)設(shè)計(jì)參照GenBank基因圖譜設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：qnrA 上游引物：5’-ATTTCTCACGCCAGGATTTG-3’，下游引物：5’-GATCGGCAA AG GTTAGGTCA-3’，擴(kuò)增片段730 bp；qnrB上游引物：5’-GATCG TGAAA GCCAGA AAGG-3’，下游引物：5’-ACGATG CCTGGTAGT TGTCC-3’，擴(kuò)增片段469 bp；aac-（6’）-Ib-cr上游引物：5’-G CTCACGCCAGGATT-3’，下游引物：5’-GATGCCTGGTAGTTGTCC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物214 bp；gyrA上游引物：5’-TGGGCAATGA CTGG AA CA -3’，下游引物：5’-GGTCGGCCATCAGTTCAT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物469 bp； parC上游引物：5’-GCGAACG ATTT CGGATCGTC-3’，下游引物：5’-CTGAATGCCAGCGCCAAATT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物423bp。qnrA、qnrB及aac-（6’）-Ib-cr擴(kuò)增條件95℃變性，55℃退火，72℃延伸，45個(gè)循環(huán)，gyrA及parC擴(kuò)增條件94℃變性、55℃退火，72℃延伸，45個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)完畢后，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠瓊脂電泳，割取目的條帶，gyrA及parC擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序過(guò)程由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 藥敏實(shí)驗(yàn)及菌株篩選結(jié)果

84株臨床分離的大腸埃希菌菌株中有24株對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥，耐藥率28.4%。所有耐藥菌株均對(duì)環(huán)丙沙星耐藥。其中對(duì)2種藥物耐藥4株（CIP、LVX耐藥2株，CIP、OFX耐藥2株），發(fā)生率4.7%，對(duì)3種藥物耐藥6株（CIP、LVX、OFX耐藥3株，CIP、OFX、SPX耐藥2株，CIP、SPX、NFX耐藥1株），發(fā)生率7.1%，對(duì)5種藥物耐藥14株，發(fā)生率16.7%，將24株耐藥菌分別編號(hào)為1～24。

2.2 耐藥菌株對(duì)環(huán)丙沙星MIC變化情況

對(duì)24株耐藥菌株進(jìn)行MIC檢測(cè)，對(duì)照菌株大腸埃希菌 ATCC25922菌株。對(duì)照菌株環(huán)丙沙星MIC<0.094 μg/L，1～24號(hào)耐藥菌株MIC值（14～56） μg/L，耐藥菌株MIC值較對(duì)照菌株增加148～596倍。

2.3 耐藥基因檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果

對(duì)24株耐藥菌株進(jìn)行PCR反應(yīng)，目的基因擴(kuò)增，其中檢出qnrA質(zhì)粒基因12株，qnrB質(zhì)?；?株，aac-（6’）-Ib-cr基因4株（圖1）?；驕y(cè)序結(jié)果顯示GyrA基因喹諾酮決定區(qū)突變11株，ParC基因決定區(qū)突變4株。基因測(cè)序結(jié)果顯示，GyrA基因突變的11個(gè)菌株中83位絲氨酸（Ser）被亮氨酸（Leu）取代9株，被天冬酰胺（Asn）取代2株，ParC基因突變4個(gè)菌株中87位天冬酰胺（Asn）被甘氨酸（Gly）取代2株，被酪氨酸（Tyr）取代2株。在耐藥菌株中，5份菌株單獨(dú)檢出qnrA，1份菌株單獨(dú)檢出qnrB，8份菌株單獨(dú)檢出GyrA基因區(qū)突變，1份菌株檢出qnrA及qnrB基因，2份檢出qnrA基因及aac-（6’）-Ib-cr基因突變，2份檢出qnrA基因及ParC突變，1份檢測(cè)出aac-（6’）-Ib-cr及GyrA突變，1份檢出qnrB及aac-（6’）-Ib-cr，1份檢出qnrB及GyrA突變，1份檢出qnrA、qnrB及ParC突變，1份檢出qnrA、qnrB及GyrA突變，見(jiàn)表1。

3 討論

大腸埃希菌是大腸桿菌屬的主要成員之一，在人體及外部環(huán)境中廣泛存在，也是主要的致病菌屬之一。近年來(lái)的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，包括大腸桿菌在內(nèi)的革蘭陰性菌屬的耐藥性不斷提高，給感染患者的臨床治療帶來(lái)困難，革蘭陰性菌的耐藥譜分布較為廣泛，甚至在應(yīng)用其高度敏感的喹諾酮類(lèi)藥物時(shí)，也存在大量的耐藥菌株，導(dǎo)致臨床抗菌治療的療效下降，甚至無(wú)效。革蘭陰性菌的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，如藥物作用靶位基因的突變，外排泵的表達(dá)等均能引起藥物耐藥。Qrn基因是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的與革蘭陰性菌耐藥有關(guān)的耐藥基因，包括qrnA、qrnB及qnrS等多個(gè)亞型[3，4]，在qrn表達(dá)的菌株，能夠引起對(duì)抗菌藥物的敏感性下降，MIC值上升，但是大部分菌屬仍能保持對(duì)抗菌藥物一定程度的敏感性[5]，部分菌株可能并不引起完全耐藥，但是其危害程度并不因?yàn)槠鋵?duì)抗菌藥物的影響偏小而減輕，由于其屬于質(zhì)粒基因，能夠在相同或不同菌株的細(xì)菌間結(jié)合轉(zhuǎn)移，甚至在不同菌屬中進(jìn)行水平傳遞，引起細(xì)菌耐藥性的傳播擴(kuò)散。

大腸埃希菌是大腸桿菌屬在人體分布最廣的菌株，近年來(lái)的研究結(jié)果顯示在大腸桿菌屬中有喹諾酮耐藥菌株的存在，我們對(duì)臨床患者痰液、膽汁及體液等標(biāo)本進(jìn)行分離檢測(cè)，分離出的84株臨床大腸埃希菌菌株有24株對(duì)喹諾酮藥物不同程度耐藥，而且同一菌株對(duì)多種喹諾酮類(lèi)藥物耐藥的情況較為多見(jiàn)，利用環(huán)丙沙星對(duì)耐藥強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，耐藥菌的MIC明顯上升。在對(duì)大腸埃希菌的耐藥機(jī)制進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，在24株耐藥的大腸埃希菌中，部分菌株有qnrA、qnrB、aac-（6’）-Ib-cr基因檢出及GyrA和ParC喹諾酮位點(diǎn)突變，而且在同一菌株中，常存在多種耐藥基因同時(shí)存在的情況，如qnrA及qnrB基因同時(shí)存在， qnrA基因和aac-（6’）-Ib-cr基因突變同時(shí)存在以及qnrA基因和GyrA喹諾酮位點(diǎn)突變同時(shí)存在等。qnr基因編碼的蛋白質(zhì)能夠同DNA回旋酶GyrA及拓?fù)洚悩?gòu)酶ParC喹諾酮位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致其免受喹諾酮類(lèi)藥物的攻擊，保持細(xì)菌DNA的轉(zhuǎn)錄及復(fù)制能力，在研究中發(fā)現(xiàn)，在qnr表達(dá)的大腸埃希菌中，同時(shí)也存在DNA回旋酶GyrA及拓?fù)洚悩?gòu)酶ParC喹諾酮位點(diǎn)氨基酸突變的情況，進(jìn)一步導(dǎo)致其對(duì)喹諾酮類(lèi)的敏感性下降，最終導(dǎo)致菌株耐藥[6，7]。aac（6’）-Ib-cr是氨基糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶的變異基因，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與喹諾酮耐藥相關(guān)的基因[8，9]，在aac（6’）-Ib-cr表達(dá)的菌株，能夠?qū)M(jìn)入細(xì)胞的喹諾酮類(lèi)藥物如環(huán)丙沙星等進(jìn)行乙?；揎梉10，11]，使藥物對(duì)GyrA及ParC喹諾酮敏感區(qū)的作用能力下降，進(jìn)而使細(xì)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的敏感性下降。既往研究顯示[12，13]，aac（6’）-Ib-cr單獨(dú)表達(dá)的菌株，其對(duì)環(huán)丙沙星的MIC上升3-4倍，雖然aac（6’）-Ib-cr通過(guò)乙?；幬锲鹱饔?，對(duì)細(xì)菌耐藥基因無(wú)明顯的修飾作用，其在結(jié)腸埃希菌的耐藥機(jī)制中作用較小，但是當(dāng)aac（6’）-Ib-cr表達(dá)同時(shí)存在qnrA、qnrB等耐藥基因時(shí)，其作用將進(jìn)一步加強(qiáng)，最終導(dǎo)致菌株耐藥[14]。

研究結(jié)果顯示，在我院分離的大腸埃希菌臨床菌株中，耐藥菌株的比例較高，而且存在qnrA、qnrB、aac-（6’）-Ib-cr等質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因存在，有引起耐藥菌株廣泛播散的可能，耐藥基因的存在及喹諾酮敏感區(qū)酶類(lèi)基因突變是引起大腸埃希菌耐藥的主要原因[15]，菌株耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，對(duì)多種喹諾酮類(lèi)藥物耐藥，需要加強(qiáng)臨床監(jiān)測(cè)，避免耐藥菌株在臨床的傳播。

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（收稿日期：2013-01-25）