人類子宮內(nèi)膜癌與mtDNA基因單倍群的相關(guān)性研究

[摘要] 目的 探討mtDNA單倍群與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性。 方法 選取2010年1月～2012年10月間于我院就診的子宮內(nèi)膜癌患者32例作為觀察組，另外選取同期在我院進(jìn)行健康體檢與其匹配的本地女性居民32名作為對照組。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法確定mtDNA單倍群，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-高溫連接酶檢測反應(yīng)（PCR- LDR）的方法檢測基因型與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性。 結(jié)果 觀察組中有16例39個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生突變，其中mtDNA基因多態(tài)性改變有5例，對照組則有4例13個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生突變，mtDNA基因多態(tài)性改變有1例。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。并對位于mtDNA中D-loop區(qū)可能具有功能性的基因多態(tài)位點(diǎn)73 G/A、16126 C/T、16189 T/C、16391 G/A和14783 A/G等進(jìn)行檢測。 結(jié)論 為確定子宮內(nèi)膜癌高危人群開辟新的途徑，為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)防和診斷提供新的科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] mtDNA；子宮內(nèi)膜癌；D-loop

[中圖分類號] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）10-0011-03

線粒體基因組也叫線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），是真核細(xì)胞中唯一存在的獨(dú)立于核DNA之外的遺傳物質(zhì)，是在細(xì)胞線粒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的脫氧核糖核酸特殊形態(tài)。mtDNA結(jié)構(gòu)簡單，缺乏組蛋白和非組蛋白保護(hù)，環(huán)境特殊，處在活性氧及其他自由基包圍之中，還缺乏有效的損傷修復(fù)系統(tǒng)[1]。因此，mtDNA易受各類誘變因素作用而發(fā)生損傷和異常，進(jìn)而可能導(dǎo)致包括人類腫瘤在內(nèi)的各種疾病的發(fā)生。目前研究發(fā)現(xiàn)，在人類多種實(shí)體瘤，包括頭頸、乳腺、肺、胃、結(jié)腸、膀胱、前列腺和卵巢等處的惡性腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)mtDNA突變或表達(dá)異常。單倍群（haplogroup）是指在分子進(jìn)化過程中出現(xiàn)的一組類似的單體型，它們擁有一個(gè)共同的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的起源[2]。然而現(xiàn)在關(guān)于mtDNA與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)性尚未得到充分的研究。本研究對子宮內(nèi)膜癌患者和健康女性血液中mtDNA中D-loop區(qū)基因多態(tài)和單倍群類型與子宮內(nèi)膜癌之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2010年1月～2012年10月間于我院就診的子宮內(nèi)膜癌患者32例作為觀察組，具體納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①經(jīng)問卷調(diào)查證實(shí)為漢族，且三代之間沒有血緣關(guān)系的舟山地區(qū)常住人口；②經(jīng)病理切片確診為子宮內(nèi)膜癌，并且嚴(yán)格按照FIGO制定的手術(shù)-病理分期進(jìn)行病理分期；③排除多囊卵巢綜合征患者；④排除長期從事放射線暴露職業(yè)者及妊娠期和哺乳期婦女。根據(jù)FIGO臨床分期[3]分為：Ⅰ期16例，Ⅱ期9例，Ⅲ期4例，Ⅳ期3例。組織學(xué)分級1級20例，2級7例，3級5例。對照組按照1∶1頻數(shù)匹配的方法，即與病例在年齡（±5歲）、居住地等因素上匹配，選取同期在我院進(jìn)行健康體檢的本地女性居民約32名作為對照組，排除曾有子宮內(nèi)膜癌病史及其癌前病變的對照。

1.2 研究方法

1.2.1 人口學(xué)及臨床資料 本研究采用的調(diào)查問卷是統(tǒng)一編制、并經(jīng)預(yù)調(diào)查評價(jià)及修訂后使用，由經(jīng)過培訓(xùn)的臨床醫(yī)師直接詢問調(diào)查對象本人后填寫。問卷調(diào)查的內(nèi)容主要包括研究對象的一般狀況（性別、年齡、婚姻、職業(yè)、文化水平等）、生活方式及習(xí)慣（如吸煙史、飲酒史、飲水史、飲茶史）、個(gè)人疾病史、腫瘤家族史、月經(jīng)生育史等。并收集所有在臨床體檢和血尿常規(guī)中的信息資料，包括血壓、血糖、腫瘤分期等。

1.2.2儀器與試劑 儀器：PCR擴(kuò)增儀、自動(dòng)核酸測序儀、冷凍高速離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀及電泳槽、生物分光光度計(jì)、-86℃深低溫冰箱、恒溫水浴箱、電子天平、移液器等。試劑：溶血試劑、核懸浮液、蛋白酶K、氯仿、冰冷無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、TE、異丙醇等用于mtDNA抽提。Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2溶液、dNTPs溶液、DMSO溶液等用于核酸擴(kuò)增。各種限制性內(nèi)切酶、瓊脂糖、0.5×TBE溶液、溴化乙錠（EB）等用于凝膠電泳。

1.2.3血樣采集及DNA抽提 確認(rèn)研究對象知情同意后，現(xiàn)場采集其外周靜脈血約 5 mL，隨后置于-80℃冰箱低溫凍存。采用酚氯仿法抽提白細(xì)胞mtDNA，即將血液經(jīng)蛋白酶K消化后加入飽和酚并振蕩離心，收集上清液加入氯仿-異戊醇振蕩離心，再收集上清液加入冰凍無水乙醇，洗滌后收集沉淀烘干備用。對抽提產(chǎn)物進(jìn)行核酸定量，并加相應(yīng)TE溶液稀釋到約50 ng/μL，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3多態(tài)基因型檢測

采用Sanger直接測序法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）等多種分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行基因分型[4]。9 bp del位點(diǎn)PCR產(chǎn)物直接使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的Nussive凝膠電泳檢測，其余應(yīng)用DNA限制性內(nèi)切酶對多態(tài)位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切（Roche公司），然后對酶切產(chǎn)物使用 3%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增創(chuàng)造酶切位點(diǎn)，引物由Introgen公司合成。

對mtDNA中D-loop區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，其中上游引物：5'GATGCT TGCATGTGTAATCT3'，下游引物：5'ATTCTAACCTGAATCGGAGG3'。主要位于mtDNA cytb和12srRNA基因區(qū)，對1 528 bp片段進(jìn)行擴(kuò)增，然后采用PCR-RFLP 法進(jìn)行基因分型，通過等位特異的內(nèi)切酶消化，切成基因片段，然后經(jīng)過凝膠電泳分離，根據(jù)一系列內(nèi)切酶解格局可確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型。Sanger雙脫氧末端終止法測序是檢測mtDNA序列多態(tài)性最常用方法，

mtDNA高變Ⅰ區(qū)（HVS21）片段使用L15974和H16488引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃ 3 min；變性94℃ 30 s，退火62℃ 40 s，延伸72℃ 40 s；30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束72℃延伸5 min，反應(yīng)體系25 μL。PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序，采用BIG DYE試劑盒熒光染料末端標(biāo)記（PE，F(xiàn)oster City，CA），包括0.6 μmol/L上游引物2 μL，MIX 2 μL，下游引物2 μL，反應(yīng)總體系12 μL。所得反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀干燥后再通過甲酰胺變性，然后使用ABI3100序列分析儀進(jìn)行序列分析（PE，F(xiàn)oster City，CA），以PCR引物進(jìn)行雙向測序，序列先從L14793一端進(jìn)行正向測序，遇上polyC片段則無法通過，再從H15376一端反向測序，在完成序列分析比對后再拼接兩段序列。

D-loop區(qū)的PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)總體系100 μL，包括DNA 模板8 μL、dNTP 2 μL、10×buffer 10 μL、Mg2+ 6 μL、上下游引物（10 pmol）8 μL、Tag酶（5 U/μL）0.8 μL。

1.4 質(zhì)量控制

本研究中為了確保收集到準(zhǔn)確、可靠的原始資料，從研究開始設(shè)計(jì)、研究對象的選擇到問卷調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室檢測、資料整理分析的過程中都進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。對參與本課題的、研究人員進(jìn)行培訓(xùn)，完成的問卷將進(jìn)行10%抽樣重復(fù)調(diào)查。對于實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，將抽取10%血液樣本進(jìn)行重復(fù)檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)過程均在SAS9.1統(tǒng)計(jì)分析軟件中完成。研究對象的人口學(xué)特征描述及比較采用χ2檢驗(yàn)、兩樣本均數(shù)采用t檢驗(yàn)；單倍群計(jì)算歸類采用haplo.stats軟件；基因多態(tài)及單倍群在研究對象中分布采用χ2檢驗(yàn)；基因多態(tài)、單倍群類型與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分析采用Logistic回歸分析；P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mtDNA的基因突變

觀察組中有16例39個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生突變，基因突變率為50%（16/32），其中mtDNA基因多態(tài)性改變有5例，基因多態(tài)性頻率為15.6%（5/32）。對照組則有4例13個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生突變，基因突變率為12.5%（4/32），mtDNA基因多態(tài)性改變有1例。兩組基因突變率與基因多態(tài)性頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.47、4.86，P < 0.05）。

2.2 DNA測序結(jié)果

子宮內(nèi)膜癌患者中有較多PCR-SSCP基因發(fā)生突變，對位于mtDNA中D-loop區(qū)可能具有功能性的基因多態(tài)位點(diǎn)73 G/A、16126 C/T、16189 T/C、16391 G/A和14783 A/G等進(jìn)行檢測。見表1。

2.3 mtDNA基因的D-loop區(qū)突變與臨床病理分期的相關(guān)性

在癌癥Ⅰ～Ⅱ期mtDNA基因突變率36.0%（9/25），Ⅲ～Ⅳ期為42.9%（3/7）。組織學(xué)中1～2級和3級的mtDNA基因突變率分別37.0%（10/27）和40.0%（2/5），差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.08、0.01，P > 0.05）。

3討論

隨著人類進(jìn)化遷移，不同地域的個(gè)體為了適應(yīng)環(huán)境，其自身的線粒體基因發(fā)生突變以改變氧化呼吸鏈的效能來適應(yīng)環(huán)境，逐漸形成了不同地域所特有的mtDNA單倍群類型。個(gè)體線粒體基因序列上的變異從一方面很好的適應(yīng)了環(huán)境贏得了生存，另一方面卻可能導(dǎo)致個(gè)體成為某些疾病的易感人群，使某種疾病的特定人群中高發(fā)[5]。盡管越來越多的證據(jù)支持mtDNA異常具有致病性，并在腫瘤發(fā)生機(jī)制中起重要作用，mtDNA突變和mtMSI作為腫瘤非侵入性臨床診斷的分子標(biāo)記物也得到了廣泛的支持。但是縱觀目前對子宮內(nèi)膜癌的線粒體基因的研究，仍然存在如下問題[6-8]：①研究重點(diǎn)放在體細(xì)胞突變上并尋找一系列體細(xì)胞mtDNA突變，但由于這些突變是后天形成，如果想在繁多的突變位點(diǎn)中找到一個(gè)腫瘤細(xì)胞共有的突變來協(xié)助臨床診斷是相當(dāng)困難的。②無論在子宮內(nèi)膜癌還是其他婦科腫瘤中，腫瘤患者mtDNA基因多態(tài)的研究非常少見。mtDNA具有母系遺傳、缺乏重組、進(jìn)化率高的特點(diǎn)，因此是一個(gè)非常好的分子生物學(xué)標(biāo)志物，將其引入子宮內(nèi)膜癌病因?qū)W的研究中，可以為明確癌癥高發(fā)人群提供線索。③迄今為止mtDNA單倍群類型與子宮內(nèi)膜癌之間的關(guān)系并沒有得到充分闡明。雖然Wu等在我國云南省開展過類似研究，但是其只納入49例病例和31例對照，樣本量偏小，人群代表性較差。

mtDNA結(jié)構(gòu)簡單，缺乏組蛋白和非組蛋白保護(hù)，環(huán)境特殊，處在活性氧及其他自由基包圍之中；mtDNA分子量小，無內(nèi)含子，在整個(gè)細(xì)胞周期中處于不斷合成的狀態(tài)，而負(fù)責(zé)mtDNA復(fù)制的DNA聚合酶γ校對能力差，而且mtDNA由D-loop區(qū)單鏈啟動(dòng)復(fù)制，容易在tRNA基因部位出現(xiàn)發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，mtDNA還缺乏有效的損傷修復(fù)系統(tǒng)[9]。因此，mtDNA易受各類誘變因素作用而發(fā)生損傷和異常，其突變率比核DNA高10～20倍。

根據(jù)近10年來的文獻(xiàn)報(bào)道，在人類多種實(shí)體瘤，包括頭頸、乳腺、肺、胃、結(jié)腸、膀胱、前列腺和卵巢等處的惡性腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)mtDNA突變或表達(dá)異常[10]。特別是mtDNA中的D-loop區(qū)緊靠電子傳遞鏈，而且D-loop區(qū)是mtDNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄的調(diào)控區(qū)，由此可推測D-loop區(qū)可能是mtDNA突變的熱點(diǎn)區(qū)域，許多報(bào)道也支持此假設(shè)。Trappen等[11]發(fā)現(xiàn)在32例原發(fā)胃癌病例中有17例（53%）存在mtDNA 4977 bp大片段的缺失，突變大多發(fā)生于D-loop區(qū)和ND1、ND2區(qū)。Pejovic等[12]對59例肝癌腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織中mtDNA進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在D-loop區(qū)的100～600 bp的堿基之間突變頻率最高，所有突變均為260 bp處G→A，489 bp處T→C的單堿基替換，以及311→312 bp之間的C插入。另外，Máximo等[13]檢測了19例肝細(xì)胞癌患者的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)有68%（13/19）存在mtDNA D-loop區(qū)的突變。Mambo等[14]對50例肝細(xì)胞癌病人進(jìn)行檢測，結(jié)果在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的100處基因變異中有34%（17/50）發(fā)現(xiàn)D-loop區(qū)的突變，并且在隨后的匹配血漿檢測中33%（5/15）在其相應(yīng)的血漿中檢測到一致的mtDNA突變。

綜上所述，mtDNA可能在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其D-loop區(qū)存在的基因多態(tài)位點(diǎn)與子宮內(nèi)膜癌之間具有顯著關(guān)聯(lián)，不同mtDNA單倍群類型的個(gè)體對子宮內(nèi)膜癌的罹患風(fēng)險(xiǎn)有所不同。本研究以舟山地區(qū)的子宮內(nèi)膜癌患者和健康居民為研究對象，采集靜脈血樣品抽提純化線粒體DNA，采用PCR技術(shù)對mtDNA中D-loop區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，明確多態(tài)位點(diǎn)的基因型并獲得mtDNA單倍群的信息，從而分析mtDNA中D-loop區(qū)基因多態(tài)和單倍群類型與子宮內(nèi)膜癌之間的相關(guān)性，為確定子宮內(nèi)膜癌高危人群開辟新的途徑，為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)防和診斷提供新的科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2013-01-07）