貓爪草總皂苷對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活性的影響

[摘要] 目的 觀察貓爪草總皂苷體外對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞活性的影響。 方法 采用系統(tǒng)溶劑法提取貓爪草總皂苷，3H-TdR摻入法和集落形成實(shí)驗(yàn)觀察貓爪草總皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果 貓爪草總皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和集落形成均有顯著性的抑制作用，呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。 結(jié)論 貓爪草總皂苷能較好地抑制HepG2細(xì)胞增殖。

[關(guān)鍵詞] 貓爪草總皂苷；人肝癌HepG2細(xì)胞；細(xì)胞增殖

[中圖分類號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）10-0003-03

中藥貓爪草（Radix ranunculus ternati）系毛茛科植物小毛茛（Ranunculus Ternatus Thunb）的干燥塊根，性溫，味甘、辛，入肝、肺經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止咳祛痰等功效[1]。臨床用于治療肺結(jié)核、淋巴結(jié)核、咽喉炎、瘧疾等癥，對(duì)肺癌、肝癌、淋巴癌、甲狀腺瘤、乳腺腫瘤等疾病已顯示出較好的治療效果[2，3]。皂苷類廣泛存在于植物中，具有廣泛的藥理活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗微生物、抗糖尿病、抗氧化、免疫促進(jìn)以及心血管和神經(jīng)保護(hù)作用等[4]。

貓爪草總皂苷對(duì)肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7[5，6]以及人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞[7-9]的生長(zhǎng)有顯著性抑制作用。目前尚沒有貓爪草皂苷對(duì)人肝癌細(xì)胞株作用研究的相關(guān)報(bào)道。本文對(duì)貓爪草總皂苷對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞活性的影響進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 貓爪草購(gòu)自浙江省立同德醫(yī)院中藥房，經(jīng)鑒定為毛茛科植物小毛茛的干燥塊根。5-氟尿嘧啶（5-Fu）：天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)1105131。

1.1.2 細(xì)胞株 人肝癌HepG2細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫提供，本實(shí)驗(yàn)室液氮保存。

1.1.3 主要試劑 RPMI-1640（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)20110720）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所，批號(hào)110304）；0.25%胰蛋白酶（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)11090901）；氚-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所，濃度1 mci/mL，比度4ci/mM，批號(hào)100430）；二甲基亞砜（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110310）。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純。

1.1.4 主要儀器 3165型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma公司）；2050型液閃儀（Packard公司）；XS-24型細(xì)胞收集儀（浙江紹興坡壙醫(yī)療器械廠）；GS-6R型離心機(jī)（Beckman 公司）；HR40-Ⅱ-A2型醫(yī)用凈化工作臺(tái)（青島海爾特種電器有限公司）；CK40-F200型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Costar公司）。

1.2 方法

1.2.1 貓爪草總皂苷的制備 貓爪草總皂苷的制備參照王愛武等的方法[5]。具體操作如下：稱取干燥的貓爪草600 g，粉碎成粗顆粒，用6倍量85%乙醇加熱回流提取3次，每次3 h，醇提液回收乙醇，用石油醚萃取3次，再以水飽和的正丁醇萃取3次，正丁醇萃取液用0.1 mol/L NaOH 萃取2次，正丁醇液回收，濃縮至浸膏，置真空干燥箱干燥至無溶劑殘留，得總皂苷。實(shí)驗(yàn)前用RPMI-1640培養(yǎng)液溶解，過濾除菌，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡觀察經(jīng)貓爪草總皂苷作用后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.2.3 3H-TdR摻入法觀察貓爪草總皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞配制成1×105/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的貓爪草總皂苷100 μL，使終濃度為6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL，每一藥物濃度做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)25 μg/mL 的5-氟尿嘧啶（5-FU）對(duì)照和10%FCS的1640培養(yǎng)液對(duì)照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后分別加入含0.3 μci 3H-TdR的1640培養(yǎng)液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)16 h，常規(guī)收集細(xì)胞，測(cè)定每個(gè)樣品每分鐘脈沖數(shù)（cpm），用三孔的平均cpm值計(jì)算出貓爪草總皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組平均cpm值/對(duì)照組平均cpm值）×100%。

1.2.4 集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞以100個(gè)/mL濃度，每孔1 mL接種于24孔板中。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的受試藥物1 mL，同時(shí)設(shè)12.5 μg/mL的5-FU對(duì)照和10%FCS的1640培養(yǎng)液對(duì)照。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置10 d。棄去培養(yǎng)液，用瑞氏染液染色，肉眼計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，結(jié)果以集落形成率（%）表示。集落形成率=集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料數(shù)據(jù)用x±s表示，兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較用Welch法和Brown-Forsythe法。所有數(shù)據(jù)均由SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

各處理組細(xì)胞經(jīng)貓爪草總皂苷處理48 h后，鏡下均可見有細(xì)胞由貼壁不同程度脫落，懸浮在培養(yǎng)液中。光鏡下見細(xì)胞變圓，體積縮小，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見較多顆粒、空泡顏色加深，呈深褐色，并出現(xiàn)片狀無細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)。對(duì)照組細(xì)胞呈多角形，貼壁生長(zhǎng)，幾乎無脫落，光鏡下見細(xì)胞完整，胞質(zhì)飽滿，相鄰細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片。見圖1～2 。

2.2 3H-TdR摻入法觀察貓爪草總皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

由表1可見，貓爪草總皂苷從12.5 μg/mL濃度開始，到200 μg/mL濃度處理48 h后對(duì)HepG2細(xì)胞均有一定的抑制作用，且呈量-效關(guān)系，以200 μg/mL皂苷抑制率為最高。皂苷處理組HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與陰性對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.3 集落形成試驗(yàn)

由表2可見，貓爪草總皂苷（12.5～200） μg/m；L濃度對(duì)HepG2細(xì)胞的集落形成均有不同程度的抑制作用，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

中草藥抗腫瘤具有毒副作用小的特點(diǎn)，有必要不斷從植物中尋找抗腫瘤藥物及拓展現(xiàn)有抗腫瘤藥物的利用范圍。研究發(fā)現(xiàn)，貓爪草皂苷可抑制多個(gè)腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)活性。王愛武等[5]研究發(fā)現(xiàn)，貓爪草總皂苷對(duì)肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的生長(zhǎng)有顯著抑制作用。尹春萍等[6]的研究也證明了貓爪草皂苷對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的生長(zhǎng)和集落形成有不同程度的抑制作用，他們還利用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明貓爪草皂苷通過提高小鼠免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。周清安等研究發(fā)現(xiàn)，貓爪草皂苷可能通過增加Ca2+濃度[7]，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)[8]，下調(diào)細(xì)胞線粒體膜電位[9]而明顯抑制人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡。孟祥虎等[10]研究發(fā)現(xiàn)貓爪草皂苷可能是通過促進(jìn)mfn2基因的表達(dá)而抑制MCF-7細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡。

肝癌是一種在我國(guó)發(fā)病率較高的惡性腫瘤，尋找針對(duì)肝癌化療藥物及輔助化療藥物已成為開發(fā)抗腫瘤藥物的熱點(diǎn)之一[11]。本研究通過倒置顯微鏡觀察貓爪草總皂苷可引起人肝癌HepG2細(xì)胞形態(tài)和顏色的改變以及成片脫落。并且與陰性對(duì)照組比較，12.5 μg/mL濃度的貓爪草總皂苷即可對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株的生長(zhǎng)和集落形成有顯著性抑制作用，隨著濃度的升高抑制作用增強(qiáng)，并呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。說明貓爪草總皂苷可能是通過降低HepG2細(xì)胞株細(xì)胞的獨(dú)立生存能力而抑制其生長(zhǎng)的。具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。此外，皂苷類成分復(fù)雜，貓爪草總皂苷中對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株起抑制作用的確切的有效成分，及其發(fā)揮作用的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究探索，從而為貓爪草的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2013-01-23）