HPLC法測(cè)定離體葡萄葉中茋化物的含量

摘要：采用HPLC法測(cè)定新疆紅提（Vitis vinifera cv. Red globe）和紫香無(wú)核（Vitis vinifera cv. NO.4 Xin nong）離體葡萄葉片中的白藜蘆醇、白藜蘆醇苷、紫檀茋、ε-二聚體葡萄素4種茋化物的含量。結(jié)果表明，4種茋化物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 0～0.999 3，平均回收率為90.2%～109.2%。新疆紅提和紫香無(wú)核離體葡萄葉片中4種茋化物含量不同，紅提葡萄葉茋化物含量相對(duì)較高，其中白藜蘆醇苷含量最高達(dá)23.73 μg/g。2種葡萄葉的茋化物含量依次均為白藜蘆醇苷>紫檀茋>白藜蘆醇>ε-二聚體葡萄素。高效液相色譜法靈敏度高，適用于葡萄葉中4種茋類化合物含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：新疆紅提（Vitis vinifera cv. Red globe）；紫香無(wú)核（Vitis vinifera cv. NO.4 Xin nong）；茋化物；離體葡萄葉；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：S132；O945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）10-2411-03

茋類化合物是具有均二苯乙烯母核或其寡聚物一類化合物的總稱。1976年，Langcake和Pryce首次發(fā)現(xiàn)葡萄（Vitis riparia）的葉片受紫外線照射、機(jī)械損傷及真菌感染時(shí)白藜蘆醇會(huì)迅速增加，認(rèn)為白藜蘆醇是在逆境或遭遇到病原侵害時(shí)分泌的一種植保素[1]。近年來(lái)，研究證實(shí)葡萄、花生、虎杖等植物材料中不但含有白藜蘆醇，而且含有云杉苷、ε-二聚體葡萄素（ε-viniferin）、紫檀茋等其他茋類化合物[2，3]。作為植保素的重要組成成分，茋類化合物除了能提高植物的抗病性外，還具有較好的藥理活性，譬如調(diào)脂、保肝、抗血栓和抗腫瘤作用[4]，而其中的白藜蘆醇則具有抗衰老、皮膚保健和美容功效[5，6]，其藥用價(jià)值受到廣泛關(guān)注。目前，白藜蘆醇主要通過(guò)植物提取、化學(xué)合成和植物組織細(xì)胞培養(yǎng)等方法獲得，其中從植物中提取的白藜蘆醇天然安全，符合人們“綠色消費(fèi)”的要求。因此，天然白藜蘆醇具有廣闊的應(yīng)用前景。

新疆葡萄資源極為豐富，為保證果實(shí)品質(zhì)，葡萄種植期間需要多次除去植株外周葉，其中以采摘葡萄后越冬除葉操作產(chǎn)生的廢棄葉為最，每畝地最多可產(chǎn)生成噸葡萄葉。因此，葡萄葉作為茋類化合物的新資源，不僅具有較大的開(kāi)發(fā)潛力，還可提高葡萄產(chǎn)業(yè)的附加值。但另一方面，利用HPLC法同時(shí)對(duì)多種茋類化合物檢測(cè)時(shí)常受到植物多酚的干擾，樣品需要液液萃取[7，8]等前處理，目前采用乙醇提取法，安全低毒，且可提取多種茋類化合物[9]。本研究通過(guò)超聲輔助提取和HPLC法，建立葡萄葉片中白藜蘆醇、白藜蘆醇苷、紫檀茋、ε-二聚體葡萄素4種茋類化合物的快速分析方法，為葡萄葉片的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采摘石河子秋季生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的美國(guó)紅提（Vitis vinifera cv. Red globe）和紫香無(wú)核（Vitis vinifera cv. NO.4 Xin nong）的后期中間葉齡葡萄葉片（含葉柄，大小相近），用去離子水洗凈，在暗室中用1∶10（V/V）去離子水浸泡12 h，瀝干，置于-80 ℃冰箱保存，備用。

白藜蘆醇（resveratrol，Res），白藜蘆醇苷（polydatin，PD）、紫檀茋標(biāo)樣（Pterostilbene，PS）購(gòu)于Sigma公司，純度≥98%；ε-二聚體葡萄素（ε-viniferin，ε-VF）購(gòu)于云力西公司，純度≥98%。

95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，購(gòu)于天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器

LC-15C型高效液相色譜儀（日本島津公司），KQ5200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器廠），AB1042N型分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），SB-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海愛(ài)朗儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 前處理 取冷凍紫香無(wú)核和紅提葉，迅速粉碎研磨，分別稱取5 g于燒杯中，加100 mL 70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇[10]，超聲提取3次，合并提取液，濃縮干燥。用甲醇定容至10 mL后，過(guò)0.25 μm微孔濾膜，待測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別稱取Res 1.2 mg，PD 1.9 mg，PS 1.3 mg和ε-VF 2.3 mg，定容至10 mL，配制成525、487、507、506 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)母液，備用。

1.3.3 色譜條件 色譜柱Atlantis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm，進(jìn)樣體積為20 μL。采用二元梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈，B為去離子水（2‰磷酸，體積分?jǐn)?shù)）；起始0.01 min時(shí)A為5%（體積分?jǐn)?shù)，下同），B為95%；到20 min時(shí)A為15%，B為85%；50 min時(shí)A為30%，B為70%；到65 min時(shí)A為70%，B為30%；到70 min時(shí)停止。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

PD、Res、PS、ε-VF標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間分別為34.247、45.579、58.561和64.583 min；標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和樣品提取液色圖譜分別見(jiàn)圖1A和圖1B。由圖1可知，本法可同時(shí)檢測(cè)樣品中的PD、Res、PS和ε-VF。

2.2 線性關(guān)系考察

精確吸取1～7 μL不同體積4種標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容于10 mL，分別配成5～35 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)工作液，記錄色譜圖及峰面積，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程，結(jié)果如表1所示。4種茋化物峰面積和濃度的相關(guān)系數(shù)為0.999 0～0.999 3，表明在設(shè)定濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)分析

精密度試驗(yàn)：精確吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)母液，配制成500 μmol/L 工作液，每次進(jìn)樣20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積RSD值。重復(fù)性試驗(yàn)：精確稱取提同一樣品粉末6份，按供上述前處理和色譜分析方法平行操作，計(jì)算峰面積RSD值。穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣20 μL，共5次，計(jì)算峰面積RSD值，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 回收率試驗(yàn)

分別取冷凍發(fā)脆的葡萄葉片，粉碎研磨樣分為4份，1份直接測(cè)定，另外3份分別加入3個(gè)水平的Res、PD、PS和ε-VF標(biāo)準(zhǔn)品，每水平設(shè)3平行，考察本法回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，該方法回收率為90.2%～109.2%，表明精密度良好。

2.5 不同品種葡萄葉樣品中茋類化合物含量比較

紫香無(wú)核葡萄葉、紅提葡萄葉中茋類化合物含量如表3所示。由表3可知，紅提PD的平均含量最高（23.73 mg/kg），紫香無(wú)核中ε-VF最低（1.05 mg/kg）。

3 小結(jié)與討論

一般條件下，葡萄中茋類化合物水平較低，新鮮葡萄皮中大約含50～100 mg/kg白藜蘆醇以及少量虎杖苷和白皮杉醇，紅皮葡萄中相關(guān)化合物含量較高。而葡萄藤莖中含有微量順式白藜蘆醇（3.5 μg/kg）及ε-viniferin（1.3 μg/kg），葡萄果肉中茋類化合物含量極低。葡萄葉片中含有少量的白藜蘆醇（0.06～46 mg/kg），且變化范圍較大。Park等[11]測(cè)定了葡萄葉片、種子、果皮等部位白藜蘆醇含量，發(fā)現(xiàn)葉片白藜蘆醇含量最高。Landrault等[12]與Bavaresco[13]發(fā)現(xiàn)葡萄葉、莖、果實(shí)中一些特殊活性的茋類化合物具潛在利用價(jià)值。另外，還有報(bào)道稱紅皮葡萄中白藜蘆醇的含量相對(duì)較高[14]。本研究比較了離體紅提和紫香無(wú)核葉片中的茋類化合物含量，發(fā)現(xiàn)紅提葡萄葉中茋類化合物含量高于紫香無(wú)核中的含量，該結(jié)果表明茋類化合物含量與品種有密切聯(lián)系。不同品種的茋類化合物含量雖然有差異，但各組分含量大小也呈現(xiàn)一定規(guī)律性，如白藜蘆醇苷>紫檀茋>白藜蘆醇>ε-二聚體葡萄素。上述結(jié)果表明在不同葡萄葉中茋類化合物積累的共性與個(gè)性特點(diǎn)。

綜上所述，本研究針對(duì)采摘后離體葡萄葉片中代表性茋類化合物，采用HPLC法對(duì)其進(jìn)行分析，方法簡(jiǎn)單、干擾小、靈敏度高、分析速度快，適用于葡萄葉中4種茋類化合物的同時(shí)快速檢測(cè)，為探討新疆北疆常見(jiàn)食用葡萄（美國(guó)紅提、紫香無(wú)核）中的茋類化合物含量提供參考。

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