馬氏珠母貝蛋白鹽提及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物研究

摘要：對(duì)馬氏珠母貝（Pinctada martensii）蛋白的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物成分及活性進(jìn)行了研究，以期為馬氏珠母貝在食品添加劑方面和抗氧化劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)，為馬氏珠母貝的綜合利用提供新的途徑。試驗(yàn)采用鹽提法提取馬氏珠母貝蛋白，探討料液比、NaCl濃度、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響，確定了鹽提馬氏珠母貝蛋白的最佳提取工藝條件為NaCl濃度0.75 mol/L、提取溫度35 ℃、提取時(shí)間80 min、料液比1∶20（m/V，g∶mL）；采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）檢測(cè)其產(chǎn)物的風(fēng)味成分，測(cè)得其產(chǎn)物主要為醇類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)化合物等；對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性的研究結(jié)果表明，馬氏珠母貝鹽提蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化性，因此可作為一種安全的天然抗氧化劑。

關(guān)鍵詞：馬氏珠母貝（Pinctada martensii）；鹽提；美拉德反應(yīng)；風(fēng)味成分；抗氧化

中圖分類(lèi)號(hào)：TS254 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）10-2397-05

馬氏珠母貝（Pinctada martensii）又名合浦珠母貝，屬軟體動(dòng)物門(mén)雙殼綱珍珠貝目珍珠貝科，是我國(guó)人工培養(yǎng)海水珍珠養(yǎng)殖最廣、數(shù)量最大的貝種[1]。馬氏珠母貝肉是一種高蛋白、低脂肪、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的海產(chǎn)品，粗蛋白含量高達(dá)74.9%[2]，但由于貝肉是海水珍珠生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物[3]，目前珍珠貝肉除一部分以鮮銷(xiāo)供食用之外，相當(dāng)一部分資源因缺乏有效的加工手段而未能得到充分利用。

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含有一定的抗氧化性物質(zhì)，具有較大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力，越來(lái)越受到人們的重視[4]。目前已有以馬氏珠母貝蛋白酶解產(chǎn)物為原料，運(yùn)用美拉德反應(yīng)制備肉味香精的研究報(bào)道[5-7]。而以鹽提法提取的馬氏珠母貝蛋白為原料的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

鹽溶法提取蛋白質(zhì)主要是由于稀鹽溶液可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解。稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子彼此排斥并使蛋白質(zhì)分子與水之間相互作用加強(qiáng)，溶解度增高。其操作方法簡(jiǎn)單易行，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)且無(wú)食品安全隱患。

研究通過(guò)鹽提法對(duì)馬氏珠母貝蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提取的蛋白質(zhì)為試驗(yàn)原料，進(jìn)行美拉德反應(yīng)，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)成分，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化性研究，旨在為資源豐富的馬氏珠母貝肉的深加工及綜合利用提供有應(yīng)用價(jià)值的基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 馬氏珠母貝采集于湛江市徐聞縣珍珠養(yǎng)殖基地的同一批次，清洗樣品后，開(kāi)殼取其肉，清洗干凈，冷凍備用；試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自日本島津有限公司，GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司，HHS型電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠， PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室酸度計(jì)購(gòu)自上海博取儀器有限公司，Kjeltec TM 2300型自動(dòng)凱氏定氮儀購(gòu)自福斯中國(guó)有限公司，玻璃儀器氣流烘干箱購(gòu)自孔義市予華儀器有限責(zé)任公司，電子天平購(gòu)自余姚銘記稱(chēng)重校驗(yàn)設(shè)備有限公司，DS-1型高速組織搗碎機(jī)購(gòu)自上海標(biāo)本模型廠，KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司，SHB-Ⅱ型循環(huán)水式多用真空泵購(gòu)自鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司，KXL-1010型控溫消煮爐購(gòu)自北京通潤(rùn)源機(jī)電有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝流程 提取工藝流程為：馬氏珠母貝肉→攪碎→鹽提→離心→上清液→酸沉→離心→冷凍干燥→蛋白質(zhì)。

1.2.2 單因素試驗(yàn) ①提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。按料液比1∶10（m/V，g∶mL，下同）加入1 mol/L NaCl溶液，分別在30、40、50、60、70 ℃條件下提取，比較不同提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。②提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。按料液比1∶10加入1 mol/L NaCl溶液，在40 ℃條件下分別提取30、60、90、120和150 min，比較不同提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。③料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。采用1 mol/L NaCl溶液為提取液，在40 ℃下，分別在料液比為1∶2、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20的條件下提取90 min，比較不同料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。④NaCl濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。分別配制0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50 mol/L NaCl溶液作為提取液，在提取溫度為40 ℃、料液比為1∶10的條件下提取90 min，比較不同NaCl濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取影響蛋白質(zhì)提取率的料液比、提取溫度、NaCl濃度、提取時(shí)間4個(gè)重要因素為正交試驗(yàn)因素，以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)，并考察各因素對(duì)提取率影響的主次順序，試驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 馬氏珠母貝肉中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用凱氏定氮法[8]，應(yīng)用FOSS自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定，進(jìn)行3次平行測(cè)定試驗(yàn)，取平均值，得馬氏珠母貝肉的蛋白質(zhì)含量為58.37%。提取液中蛋白質(zhì)的含量采用雙縮脲法測(cè)定[9]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)試樣。

蛋白質(zhì)提取率=■×100%

1.2.5 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和沉淀率的測(cè)定 將馬氏珠母貝蛋白提取液用HCl分別調(diào)至pH 3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4，使蛋白質(zhì)沉淀，離心后取上清液進(jìn)行比色測(cè)定，吸光度最小的即為等電點(diǎn)。

蛋白質(zhì)沉淀率=■×100%

1.2.6 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備 在葡萄糖添加量為30 g/L、馬氏珠母貝肉鹽提物含水量為70%、反應(yīng)起始pH 6.5、反應(yīng)溫度為100 ℃、反應(yīng)時(shí)間為22 min的工藝條件下制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[5]。試驗(yàn)步驟：準(zhǔn)確稱(chēng)取配料（馬氏珠母貝肉提取蛋白、葡萄糖） 放入錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH，塞好塞子后放入集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，加熱至100 ℃并維持22 min，停止加熱并在冰水浴中快速冷卻，用乙醚萃取3次反應(yīng)產(chǎn)物，收集每次的乙醚萃取液，減壓濃縮至約0.5 mL，置于4 ℃保存，供GC-MS分析使用。

1.2.7 GC-MS分析

1）GC條件。毛細(xì)管柱，載氣為氦氣；柱溫：50 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；分流比：20∶1；柱壓：53.6 kPa；總流量：24.0 mL/min；柱流量：1.00 mL/min；載氣流量：3.0 mL/min；柱溫箱升溫程序：50 ℃保持1 min后，以10 ℃/min升溫至280 ℃，保持30 min。

2）MS條件。EI離子源，電子倍增器的電壓為950 eV；離子源溫度：200.00 ℃；接口溫度：230.00 ℃；掃描時(shí)間4.5～30.0 min；掃描質(zhì)量范圍20.00～500.00 amu。

1.2.8 還原能力的測(cè)定 采用鐵氰化鉀還原法測(cè)定[10]。取1 mL美拉德反應(yīng)產(chǎn)物溶液（體積分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%及10%），分別加入0.2 mol/L、pH 6.6的磷酸鈉緩沖溶液1 mL和10 g/L鐵氰化鉀1 mL，于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，然后急速冷卻，加入100 g/L 三氯乙酸溶液1 mL，以4 000 r/min離心5 min。取上清液1 mL，加入去離子水2 mL及1 g/L FeCl3溶液1 mL，混勻。10 min后于700 nm處測(cè)定其吸光度，吸光度越大表明還原能力越強(qiáng)，每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)，取平均值。

1.2.9 ·OH清除率的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[11]。取0.5 mL含0.75 mmol/L鄰二氮菲的無(wú)水乙醇溶液于試管中，依次加入1 mL 0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）和0.5 mL去離子水，充分混勻后，加入0.5 mL 0.75 mmol/L的FeSO4·7H2O溶液，混勻后，加入0.5 mL 0.01% H2O2，于37 ℃水浴反應(yīng)60 min。在536 nm快速測(cè)定其吸光度，所得的數(shù)據(jù)為損傷管的吸光度（A損）。以0.5 mL去離子水代替損傷管中0.5 mL 0.01% H2O2，可測(cè)得536 nm未損傷管的吸光度（A未）。樣品管以0.5 mL不同濃度樣品代替損傷管中的0.5 mL去離子水，可測(cè)得536 nm樣品管的吸光度（A樣）。每個(gè)樣品做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值，計(jì)算清除率。

清除率=■×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)馬氏珠母貝蛋白提取率的影響

2.1.1 提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖1可知，在30～40 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨著提取溫度的升高而上升，這可能是因?yàn)轶w系溫度升高，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生輕微的改變，分子的立體結(jié)構(gòu)變得伸展，有利于蛋白質(zhì)分子和水分子的運(yùn)動(dòng)及其相互作用，蛋白質(zhì)的滲透、溶解、擴(kuò)散速度也加快，因而蛋白質(zhì)更易于從原料中溶出；當(dāng)提取溫度到達(dá)40 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最高，為62.7%；之后隨著提取溫度的升高，提取率明顯降低，這可能是隨著提取溫度的升高，維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵被破壞，把原來(lái)在分子內(nèi)部的一些疏水基團(tuán)暴露到分子表面，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子間的相互結(jié)合而凝結(jié)沉淀，從而影響了蛋白質(zhì)的溶解性，故提取溫度取40 ℃為宜。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖2可知，在提取時(shí)間為30～90 min時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)提取率逐漸增大。在提取時(shí)間為90 min時(shí)，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大，為61.0%；此后再延長(zhǎng)提取時(shí)間，蛋白質(zhì)提取率呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)檠娱L(zhǎng)提取時(shí)間會(huì)使蛋白質(zhì)的水解程度加深，同時(shí)提取時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)增加條件上的不穩(wěn)定性，可能會(huì)使部分蛋白質(zhì)變性，而且長(zhǎng)時(shí)間的提取會(huì)加大成本[12-14]。因此，確定90 min為最佳提取時(shí)間。

2.1.3 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖3可知，在提取過(guò)程中，當(dāng)料液比為1∶2時(shí)，蛋白質(zhì)提取率不高，這可能是因?yàn)樘崛∫河昧窟^(guò)小，原料不易浸透，當(dāng)提取液的料液比從1∶2降低至1∶15時(shí)，蛋白質(zhì)提取率上升較快；當(dāng)料液比小于1∶15后，盡管蛋白質(zhì)提取率有所升高，但變化不大。這可能是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑萃取是固相和液相之間的擴(kuò)散過(guò)程，在一定范圍內(nèi)增加提取液用量能增加固相和液相的接觸面積，提高溶劑擴(kuò)散率和傳質(zhì)速率[15]；但料液比太小，增加了后處理的負(fù)擔(dān)，特別是在工業(yè)上，會(huì)使成本增大，因此，料液比選1∶15為宜。

2.1.4 NaCl濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖4可知，隨著NaCl濃度的加大，馬氏珠母貝蛋白的提取率逐漸提高。當(dāng)NaCl濃度為1.25 mol/L時(shí)提取率最高，為64.6%。此后，繼續(xù)增加NaCl濃度，其提取率反而下降。這可能是由于較低濃度的NaCl溶液的鹽溶作用可促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解，而NaCl濃度過(guò)高，物料中的許多黏性物質(zhì)和鹽膠團(tuán)的形成降低了蛋白質(zhì)溶出。蛋白質(zhì)本身也是一種膠體分子，離子強(qiáng)度過(guò)大，會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉降。NaCl濃度過(guò)大不但會(huì)產(chǎn)生鹽析作用，而且會(huì)影響蛋白質(zhì)的純化，從而影響提取率。所以鹽提馬氏珠母貝蛋白的最適NaCl濃度為1.25 mol/L。

2.2 馬氏珠母貝蛋白鹽提工藝的優(yōu)化結(jié)果

由表2可知，影響馬氏珠母貝蛋白提取率的因素順序依次為D（料液比）>C（提取時(shí)間）>B（提取溫度）>A（NaCl濃度），其中料液比對(duì)提取率的影響最大。采用鹽提法從馬氏珠母貝提取蛋白質(zhì)的最佳提取條件為A1B2C2D3，即NaCl濃度0.75 mol/L、提取溫度35 ℃、提取時(shí)間80 min、料液比1∶20。

2.3 馬氏珠母貝蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果

蛋白質(zhì)的粗分離一般有等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法及色譜法等。由于等電點(diǎn)沉淀法比鹽析法和色譜法操作方便，又比較經(jīng)濟(jì)，本試驗(yàn)通過(guò)HCl調(diào)節(jié)pH的等電點(diǎn)使抽提的蛋白質(zhì)沉淀，離心后取上清液進(jìn)行比色測(cè)定，在pH 3.8時(shí)，上清液的吸光度最小，此即為馬氏珠母貝蛋白的等電點(diǎn)。當(dāng)pH 3.8時(shí)，蛋白質(zhì)沉淀率為36.6%。

2.4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味成分的分析

在試驗(yàn)確定的美拉德反應(yīng)條件下制取肉味香料，用GCMS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。通過(guò)計(jì)算機(jī)在譜庫(kù)中查找與各色譜峰相似匹配指數(shù)高的化合物，對(duì)相似匹配指數(shù)80%以上的化合物進(jìn)行了鑒定，并用峰面積歸一化計(jì)算各組分相對(duì)含量，共鑒定出了61個(gè)組分（表3）。由表3可知，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物主要為醇類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、烷烴類(lèi)、羧酸類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)化合物等，其中雜環(huán)類(lèi)化合物主要是吡嗪類(lèi)、吡咯類(lèi)、噻吩類(lèi)、呋喃類(lèi)、吲哚等。如醇類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量為16.00%。

醛類(lèi)物質(zhì)主要是貝肉中脂肪氧化和烷氧基自由基分解而產(chǎn)生，能在脂質(zhì)氧化中快速形成，對(duì)貝肉風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)很大[16]。酯類(lèi)物質(zhì)可能是脂質(zhì)代謝生成的羧酸和醇的酯化作用的產(chǎn)物。酯能給予一種甜的果香，故它們對(duì)貝肉果香風(fēng)味可能貢獻(xiàn)很大。雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)含量雖不高，但對(duì)貝肉風(fēng)味的貢獻(xiàn)比較多，尤其是呋喃型化合物，它們對(duì)煮熟或烤熟的肉的整體風(fēng)味有貢獻(xiàn)。

2.5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還原能力的測(cè)定結(jié)果

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化效果與還原能力密切相關(guān)。還原能力的測(cè)定是以樣品是否為良好的電子供體為指標(biāo)，還原能力大的樣品是良好的電子供體，其供應(yīng)的電子不僅能使Fe3+還原成Fe2+，同時(shí)能與自由基反應(yīng)，使自由基成為較為穩(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷自由基連鎖反應(yīng)，在700 nm處吸光度越大表明樣品的還原能力越強(qiáng)。馬氏珠母貝蛋白-葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的還原能力見(jiàn)圖6，由圖6可知，隨著美拉德反應(yīng)產(chǎn)物體積分?jǐn)?shù)的增加，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還原能力隨之增強(qiáng)，說(shuō)明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有一定的抗氧化性。

2.6 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)·OH的清除作用

羥基自由基（·OH）清除率是反映物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)。·OH在其氧原子上含有一個(gè)未配對(duì)電子，奪取電子的能力很強(qiáng)，是體內(nèi)最活潑的活性氧，可導(dǎo)致許多病理變化。在過(guò)渡金屬離子催化作用下，H2O2可發(fā)生均裂產(chǎn)生·OH。反應(yīng)式如下：H2O2+Fe2++H+→·OH+H2O+Fe3+。由圖7可知，馬氏珠母貝蛋白-葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)·OH的清除率隨美拉德反應(yīng)產(chǎn)物體積分?jǐn)?shù)的增加而增強(qiáng)，清除率最高達(dá)到82.1%。

3 結(jié)論

研究對(duì)馬氏珠母貝蛋白的鹽提工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了馬氏珠母貝蛋白的最佳鹽提條件；以提取的蛋白質(zhì)為試驗(yàn)原料，制取美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析其醚溶性成分。結(jié)果表明，其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中風(fēng)味成分種類(lèi)豐富，主要為醇類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、羧酸類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)化合物等，可作為一種天然的食品添加劑；此外，還對(duì)其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明馬氏珠母貝鹽提蛋白-葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化性，其還原能力和對(duì)·OH的清除率隨著體積分?jǐn)?shù)的增大而增強(qiáng)，因此也可作為一種安全的天然抗氧化劑。

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