鹽堿湖桿菌菌株MIM18的培養(yǎng)特性

摘要：對分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)渾善達(dá)克鹽堿湖的一株桿菌菌株MIM18的培養(yǎng)特征進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該菌為革蘭氏陽性桿菌，粉紅色，分泌過氧化氫酶、精氨酸雙水解酶和賴氨酸脫羧酶，對常見的抗生素高度敏感。生長鹽濃度為0～55 g/L，最適鹽濃度為10 g/L；溫度范圍24～40 ℃，最適溫度33 ℃；pH 6.0～11.0，最適pH 9.5。好氧，屬于兼性嗜堿菌。

關(guān)鍵詞：鹽堿湖；兼性嗜堿菌；培養(yǎng)特征

中圖分類號：Q93-335 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2295-04

嗜堿菌是一類最適生長于pH大于或等于9的環(huán)境中的微生物，根據(jù)它們在pH 7 條件下生長與否可分為專性嗜堿菌和兼性嗜堿菌兩大類[1，2]。對于嗜堿菌新菌株的分離、堿性蛋白酶的基因克隆和應(yīng)用、極端環(huán)境適應(yīng)機(jī)制、結(jié)構(gòu)新穎的活性產(chǎn)物的分離都是當(dāng)今極端環(huán)境微生物研究的熱點(diǎn)[3-6]。嗜堿菌已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)、石油化工、農(nóng)作物生長改良和環(huán)境污染物的生物修復(fù)等多個領(lǐng)域[7，8]。目前，對嗜堿菌的嗜堿機(jī)理研究又有了新的重要突破[9]。

內(nèi)蒙古有廣闊的鹽堿湖分布，蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，其中嗜堿微生物呈現(xiàn)較高的生物多樣性[10，11]。嗜堿菌有很高的經(jīng)濟(jì)價值和生產(chǎn)應(yīng)用潛力，對其進(jìn)行深入研究和開發(fā)利用，將成為我國戰(zhàn)略生物資源的平臺之一，有利于發(fā)揮生物技術(shù)創(chuàng)新的支撐作用。因此，對分離于渾善達(dá)克鹽堿湖的一株嗜堿菌的基本特征進(jìn)行了分析，以期為進(jìn)一步認(rèn)識和開發(fā)內(nèi)蒙古地區(qū)的極端環(huán)境微生物資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鹽堿湖桿菌菌株 鹽堿湖桿菌菌株MIM18由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物研究所從內(nèi)蒙古渾善達(dá)克鹽堿湖中分離獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）液體培養(yǎng)基。酵母粉2 g/L，蛋白胨2 g/L，K2HPO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，NaCl 10 g/L，微量元素1 mL/L，微生素 100 μL/L，pH 9～10。

2）固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂15 g/L制成。

3）半固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂4 g/L制成。

4）微量元素溶液配方（g/L）。FeCl3 0.05，MnSO4·H2O 0.02，H3BO3 0.01， CuSO4·5H2O 0.01，（NH4）6Mo7O24 ·4H2O 0.02，ZnSO4 0.01 g，EDTA 0.5，CaCl2·2H2O 0.2。

5）微生素溶液配方（g/L）。生物素 0.02，VB1 0.02，VB12 0.001，硫辛酸 0.05。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)特征和生長曲線的繪制 通過革蘭氏染色和平皿劃線培養(yǎng)的方法來觀察MIM18的基本形態(tài)特征。將MIM18菌種接種于含100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置33 ℃、200 r/min水浴搖床光照培養(yǎng)。隔時取樣于600 nm處測定吸光度。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.2 耐鹽試驗 調(diào)整培養(yǎng)基中鹽濃度分別為0、10、20、30、40、50、55、60 g/L。固體培養(yǎng)基平皿劃線光照培養(yǎng)測定MIM18的耐鹽程度；液體培養(yǎng)基（裝液量為100 mL/（250 mL），接種量2%）33 ℃、200 r/min水浴搖床培養(yǎng)3 d后于600 nm處測定吸光度，每個梯度3個平行[12，13]。

1.2.3 pH對生長的影響 調(diào)整培養(yǎng)基的pH分別為5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、11.5、12.0，培養(yǎng)測定方法同1.2.2。

1.2.4 溫度對生長的影響 采用含NaCl的培養(yǎng)基，分別置于0、24、27、30、33、36、40、42 ℃的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)測定方法同1.2.2。

1.2.5 氧氣對生長的影響 半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，每12 h觀察一次。觀察菌體的生長情況及位置。液體靜置和搖床培養(yǎng)，觀察菌體在液體中的分布。

1.2.6 光照對產(chǎn)色素的影響 劃線接種固體培養(yǎng)皿3個，兩個平皿用錫箔紙包住避光培養(yǎng)，24 h后將錫箔紙中的一個平皿光照培養(yǎng)，另一個仍避光培養(yǎng)，第三個平皿一直光照培養(yǎng)。

1.2.7 產(chǎn)酶種類和抗生素敏感性分析 產(chǎn)酶種類測定參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]和文獻(xiàn)[15]中的方法進(jìn)行?？股孛舾行栽囼灢捎盟幟艏埰瑱z測法[16]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIM18的生長曲線

通過7 d的恒溫?fù)u床培養(yǎng)和吸光度測定，繪制出MIM18的生長曲線（圖1）。從圖1可以清晰看到0～12 h為延滯期，12～72 h為指數(shù)生長期，72～120 h為穩(wěn)定期，120 h后進(jìn)入衰亡期。

2.2 鹽濃度對MIM18生長的影響

經(jīng)過培養(yǎng)，MIM18可在鹽濃度0～55 g/L范圍內(nèi)生長。對比各鹽濃度的生長狀況發(fā)現(xiàn)，在鹽濃度0～40 g/L時均能較好地生長。鹽濃度為0 g/L時，菌落的顏色明顯淡于鹽濃度10～40 g/L時的菌落顏色（圖2、圖3）。鹽濃度為50 g/L時，有少數(shù)菌落生長，鹽濃度為55 g/L時只有5個左右的小菌落，鹽濃度≥60 g/L時幾乎不生長。說明低鹽有利于MIM18的生長，過高的鹽濃度將會抑制其生長。通過不同鹽濃度培養(yǎng)后測定吸光度比較發(fā)現(xiàn)（圖4），MIM18在鹽濃度0～10 g/L范圍內(nèi)隨著鹽濃度升高有利于MIM18的生長，在鹽濃度為10 g/L時生長情況最好；在鹽濃度10～40 g/L時抑制MIM18的生長，但抑制效果不明顯，當(dāng)鹽濃度為40 g/L以上時MIM18的生長明顯受到抑制。

2.3 pH對MIM18生長的影響

經(jīng)平板培養(yǎng)可知，MIM18適應(yīng)pH變化能力較強(qiáng)，能在pH 6.0～11.0環(huán)境下生長。當(dāng)pH≤5.5或≥11.5時該菌株不生長。當(dāng)pH 6.0、7.0和11.0時該菌株生長比較緩慢；pH 8.5～10.0時MIM18生長隨pH的增大逐漸加快，pH 9.5時最適生長，生長最快，也最先達(dá)到穩(wěn)定期，之后生長量隨pH增大而減小（圖5）。

2.4 溫度對MIM18生長的影響

經(jīng)平板培養(yǎng)可知，MIM18的生長溫度范圍為24～40 ℃，大于40 ℃時不再生長。從圖6可以看出，33～36 ℃為MIM18生長的適宜溫度范圍。

2.5 氧氣對MIM18生長的影響

半固體培養(yǎng)基穿刺光照培養(yǎng)24 h后，穿刺孔上部有生長跡象，之后半固體斜面生長跡象加強(qiáng)，穿刺孔中生長跡象逐漸減弱直至消失；液體培養(yǎng)時，只在液面處生長，說明氧氣是MIM18生長的必要條件，MIM18不具有運(yùn)動性。搖床振蕩培養(yǎng)與靜置培養(yǎng)對比結(jié)果表明搖床培養(yǎng)條件下MIM18的生長狀況明顯優(yōu)于靜置培養(yǎng)，說明搖床培養(yǎng)提供的氧氣對MIM18生長有重要作用。

2.6 光照對MIM18產(chǎn)色素的影響

如圖7所示，3種光照處理方式下MIM18生長狀況、菌落形態(tài)基本一致，說明光照對MIM18的色素合成乃至生長無影響。

2.7 MIM18的產(chǎn)酶種類和抗生素敏感性

經(jīng)測定，該菌株在生長中產(chǎn)生接觸酶（過氧化氫酶）、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶，不產(chǎn)生脲酶、苯丙氨酸脫氨酶、酯酶；甲基紅和硫化氫試驗為陽性；它對常見的抗生素（青霉素-G、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、羅紅霉素、多粘菌素、卡那霉素、妥布霉素、利福平、桿菌肽）均表現(xiàn)為高度敏感。

3 結(jié)論與討論

MIM18在鹽濃度0～40 g/L范圍內(nèi)都能較好生長，適應(yīng)能力較強(qiáng)，甚至在無鹽條件下也能生長，在鹽濃度10 g/L時就能達(dá)到最適鹽濃度，說明其生長對鹽量要求不大，當(dāng)鹽濃度超過40 g/L時生長明顯受到了抑制，因此MIM18不是嗜鹽菌[10]；MIM18不僅能在強(qiáng)堿條件下生長而且能在pH 7下生長，因此是兼性嗜堿菌[11]。另外，MIM18在溫度方面要求也不十分嚴(yán)格，30～36 ℃生長差異不是很大。MIM18對pH和周圍環(huán)境的氧氣量變化很敏感，氧氣是其生長的必要條件，光照對其色素合成乃至生長沒有影響。

嗜堿菌是鹽堿湖中數(shù)量大、分布廣的極端微生物。由于其獨(dú)特的環(huán)境適應(yīng)模式，特殊的生理機(jī)制，獨(dú)特的基因類型，并有多種代謝產(chǎn)物可以利用，因而不僅成為了生命科學(xué)理論研究的理想材料，而且成為一類具有很大開發(fā)潛力的生物資源[17]。近年來，嗜堿微生物的研究發(fā)展迅速，已應(yīng)用于諸如清潔劑生產(chǎn)[18]、生物表面活性劑[19]、農(nóng)作物生長促進(jìn)劑[20]和天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化、環(huán)境污染物降解[8，21，22]等多個方面。對鹽堿湖菌的深入研究，不僅可以開發(fā)新的微生物基因資源，而且將大大促進(jìn)微生物在人類健康、環(huán)境保護(hù)和生物技術(shù)等領(lǐng)域的利用。

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