油菜秸稈纖維素降解菌的篩選及復(fù)合菌劑的降解特性

摘要：從土壤、腐爛的木樁和成品肥料中篩選高效降解油菜秸稈纖維素的菌株，并通過正交試驗(yàn)對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)配組合，篩選出一組高效降解油菜秸稈的復(fù)合菌劑，其羧甲基纖維素（CMC）酶活性為12 704.3 U/g，濾紙（FP）酶活性為1 227.7 U/g，秸稈失重率為25.65%，初步鑒定該菌劑組成為地衣芽孢桿菌B4、鏈霉菌A8、米根霉M3和木霉X1。采用此復(fù)合菌劑以油菜秸稈粉為降解原料進(jìn)行14 d的發(fā)酵，纖維素降解率為33.10%，半纖維素降解率為23.70%，相比于不加菌劑的對(duì)照組，自制菌劑的纖維素、半纖維素降解率分別提高了24.50%和15.60%。

關(guān)鍵詞：油菜秸稈；纖維素降解菌；復(fù)合菌系；降解特性

中圖分類號(hào)：Q93-331；TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）10-2264-04

中國油菜種植面積和產(chǎn)量常年居于世界首位，2009年油菜播種面積為700×104 hm2[1]，如此巨大的油菜種植面積，在菜子收獲后必將產(chǎn)生大量的廢棄油菜秸稈。據(jù)測(cè)定，油菜秸稈中含有豐富的氮、磷、鉀及有機(jī)質(zhì)等營養(yǎng)成分，然而，目前油菜秸稈并沒有得到合理的利用，大量的秸稈被直接焚燒，這不僅污染了環(huán)境，同時(shí)造成了資源和能源的極大浪費(fèi)[2，3]。因此，如何有效地開發(fā)利用油菜秸稈，發(fā)揮其潛在資源價(jià)值，成為當(dāng)前亟待解決的問題。

油菜秸稈的主要成分是木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，木質(zhì)素含量為16%～21%，纖維素為38%～42%[4]，木質(zhì)纖維素的高含量是阻礙其資源化利用的關(guān)鍵。提高富含纖維素的工農(nóng)業(yè)廢棄物的利用率，已成為近年來研究的熱點(diǎn)[5]，目前對(duì)纖維素類物質(zhì)的有效利用主要采取生物法，利用微生物手段使其達(dá)到資源化處理和利用[6]。而且油菜秸稈細(xì)胞壁的結(jié)晶度較高，木質(zhì)素與纖維素之間鑲嵌形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如其他主要糧食作物秸稈，針對(duì)油菜秸稈的微生物處理在國內(nèi)外鮮有報(bào)道[7]。為此，以降解油菜秸稈纖維素為目的，通過從土壤、腐爛的木樁和成品肥料中篩選油菜秸稈纖維素的高效降解菌株，并對(duì)菌種的復(fù)配組合以及降解特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 智能人工氣候箱，電熱恒溫水浴鍋，恒溫干燥箱，722型可見分光光度計(jì)，電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱等。

1.1.2 樣品

1）華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)油菜種植地收集油菜秸稈及離地面深約15～20 cm處的潮濕土壤；校門口一棵腐爛的木樁上取朽木樣。樣品自然風(fēng)干后磨碎，過20目篩，裝入塑料封口袋，至4 ℃冰箱中保存。

2）市售某品牌秸稈腐熟劑。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基；馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基；高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基；剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基；固體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：油菜秸稈粉10 g，無機(jī)營養(yǎng)液25 mL，料水比1∶2.5，pH自然，分裝于250 mL三角瓶中。無機(jī)營養(yǎng)液：（NH4）2SO4 1%，KH2PO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.025%。

1.2 方法

1.2.1 油菜秸稈纖維素降解菌的篩選 稱取10.0 g樣品，加入裝有90.0 mL無菌水以及玻璃珠的250 mL三角瓶中，在搖床上180 r/min 振蕩30 min，使樣品完全分散后取出，進(jìn)行系列梯度稀釋，取稀釋液涂布在剛果紅纖維素粉鑒別培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，選擇周圍有透明水解圈的菌株進(jìn)行劃線分離，直到得到單菌落。將純化后的菌株以點(diǎn)種的方式接種于剛果紅纖維素平板培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，每天測(cè)定纖維素降解圈直徑（H）和菌落直徑（C），并根據(jù)降解圈直徑與菌落直徑之比H/C的大小確定初篩菌株。

采用DNS法[8]測(cè)定CMC酶活性和FP酶活性，將初篩菌株接種于以油菜秸稈粉為惟一碳源的固體培養(yǎng)基中，發(fā)酵產(chǎn)酶4 d后提取粗酶液，通過酶活性比較，最終篩選出油菜秸稈纖維素降解菌株。

纖維素酶活性定義：參照國際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定的國際單位IU，將酶活性單位定義為：在特定條件（pH 4.8、50 ℃）下，1 mL酶液每分鐘催化底物生成1 μg葡萄糖所需要的酶量。10 g發(fā)酵曲溶于100 mL的提取液中，則：

E=（W×N×1 000）/（t×0.1V）

式中，E為酶活性，單位U/g ，W為葡萄糖量， N為酶液稀釋總倍數(shù)，t為反應(yīng)時(shí)間，V為酶液體積。

1.2.2 菌株復(fù)配組合篩選

1）菌株拮抗試驗(yàn)。對(duì)最終篩選出的19株纖維素降解菌作拮抗試驗(yàn)。方法如下：細(xì)菌-細(xì)菌、細(xì)菌-放線菌、放線菌-放線菌，將兩種不同的菌株在LB平板上劃線但不相交；霉菌-細(xì)菌、霉菌-放線菌，先用接種針挑取少量霉菌菌絲或孢子，點(diǎn)種于PDA平板中央，恒溫培養(yǎng)1～2 d，待霉菌直徑約5 cm時(shí)，在其周圍點(diǎn)種細(xì)菌或放線菌；霉菌-霉菌，用接種針分別挑取兩種不同的霉菌點(diǎn)接于同一個(gè)PDA平板上。以上平板均靜置于30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，觀察生長過程中是否有拮抗、抑制孢子的生成、抑菌線等現(xiàn)象。

2）復(fù)合菌劑正交試驗(yàn)。將不產(chǎn)生拮抗現(xiàn)象的15株菌株制成菌液或孢子懸液，各菌株按等體積10%的總接種量，接種于以油菜秸稈粉為惟一碳源的固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，進(jìn)行正交試驗(yàn)。30 ℃靜置培養(yǎng)，4 d后測(cè)其CMC酶活性和FP酶活性及秸稈失重率，篩選較優(yōu)菌株組合。

將第一次正交試驗(yàn)后篩選出的7株較優(yōu)組合，即B4、M1、M3、X1、X5、A3和A8進(jìn)行第二次正交試驗(yàn)，以期在減少微生物種類的同時(shí)，提高復(fù)合菌劑的降解效率，進(jìn)一步降低復(fù)合菌劑制備成本。

3）復(fù)合菌劑的鑒定。對(duì)二次正交試驗(yàn)篩選出的復(fù)合菌劑進(jìn)行菌種鑒定。細(xì)菌鑒定按《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》[9]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]， 進(jìn)行16S rRNA及形態(tài)觀察和生理生化鑒定。放線菌的鑒定主要依據(jù)《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[11]和《放線菌研究應(yīng)用》[12]進(jìn)行。真菌鑒定主要依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》[13]，以菌落特征和形態(tài)特征鑒定為主。

1.2.3 復(fù)合菌劑的制備及降解特性研究

1）復(fù)合菌劑的制備。將通過初篩、復(fù)篩、拮抗試驗(yàn)以及兩次正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)菌株組合中的菌株分別擴(kuò)大培養(yǎng)后與滅菌后的麩皮按1∶1的比例混勻[14]，在各菌株適宜溫度下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，晾干備用。將制得單一菌劑按等質(zhì)量比為1∶1∶1∶1混合均勻，即得秸稈纖維素降解復(fù)合菌劑。

2）降解特性研究。將自制復(fù)合菌劑與市售菌劑按1% 接種于裝有200 g油菜秸稈粉的敞口塑料方盒中，添加0.5% 尿素作為氮源，調(diào)節(jié)秸稈含水量至65%～70%，接種量為秸稈干重的1%。30 ℃培養(yǎng)兩周，每隔兩天取樣，至4 ℃冰箱保存。測(cè)定各組秸稈失重率和秸稈纖維素、半纖維素及木質(zhì)素含量的變化，考查自制菌劑的降解效率。試驗(yàn)一共設(shè)3個(gè)處理：不添加任何菌劑（CK1）、添加市售腐熟劑（CK2）、接種自制復(fù)合微生物菌劑（T）。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

秸稈失重率的測(cè)定：先用濾紙過濾培養(yǎng)物，將殘留物水洗至中性，105 ℃烘干至恒重。減量法計(jì)算，即：

秸稈失重率=（W-W1）/W×100%

式中，W為產(chǎn)酶發(fā)酵前秸稈的干重；W1為產(chǎn)酶發(fā)酵后剩余秸稈的干重。

秸稈纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率的測(cè)定方法按文獻(xiàn)[15-17]測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜秸稈纖維素降解菌株的篩選結(jié)果

通過纖維素降解圈的測(cè)定篩選出H/C>1的纖維素降解菌株71株，其中細(xì)菌28株，放線菌25株，霉菌18株。將初篩得到的71株產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行固態(tài)產(chǎn)酶發(fā)酵，測(cè)其發(fā)酵后粗酶液的CMC酶活性和FP酶活性，按酶活性大小排序篩選出纖維素酶活性較高的菌株19株。分別是細(xì)菌B3、B4、B8、B11、B15、B19、B23，放線菌A3、A6、A8、A21、A22，霉菌M1、M3、M4、M8、M11、X1和X5。

2.2 復(fù)合微生物菌劑的制備結(jié)果

2.2.1 菌株間的拮抗試驗(yàn)結(jié)果 分別對(duì)復(fù)篩得到的19株菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，觀察生長過程中是否有拮抗、抑制孢子的生成、抑菌線等現(xiàn)象。結(jié)果表明，4株細(xì)菌即B8、B11、B15和B23對(duì)霉菌有拮抗作用，剩余的15株菌株之間均無拮抗現(xiàn)象，因此試驗(yàn)選擇此15株菌株作為進(jìn)一步研究對(duì)象。

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 將拮抗試驗(yàn)后篩選的15株菌株以正交試驗(yàn)得到所產(chǎn)纖維素酶活性較高的微生物組合，結(jié)果見表1。由表1可知，經(jīng)過兩次正交試驗(yàn)篩選得到復(fù)合菌劑的最優(yōu)組合，其CMC活性為（12 704.3±1 087.1） U/g，F(xiàn)P為（1 227.7±45.7） U/g，微生物組成為細(xì)菌B4、霉菌M3、X1、放線菌A8。

2.2.3 菌株的鑒定 鑒定結(jié)果表明，B4為芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），A8為鏈霉菌（Sterptomyces），M3為米根霉（Rhizopus oryzae），X1來自木霉屬（Trichoderma）。

2.3 復(fù)合菌劑對(duì)油菜秸稈的降解效果

2.3.1 油菜秸稈纖維素、半纖維素及木質(zhì)素含量的變化 以油菜秸稈粉為降解原料進(jìn)行14 d的發(fā)酵，分別對(duì)3種處理（不添加菌劑處理CK1、添加市售菌劑處理CK2、添加自制復(fù)合菌劑處理T）的秸稈纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量進(jìn)行了測(cè)定。

從圖1可以看出，CK2和T的秸稈纖維素含量在前6 d分別減少15.8%和16.5%，在14 d發(fā)酵結(jié)束時(shí)，兩組纖維素含量分別減少26.6%和33.1%。與CK1相比，二者的纖維素含量減少顯著。處理T對(duì)纖維素的降解效果好于CK2，14 d時(shí)其秸稈纖維素的降解率比CK2高6.5個(gè)百分點(diǎn)，可見自制復(fù)合菌劑對(duì)秸稈纖維素的降解效果具有良好的效果。原因可能是此次試驗(yàn)以纖維素酶為測(cè)定指標(biāo)篩選目的菌株，然后對(duì)確定的菌株進(jìn)行組合制備復(fù)合菌劑，在功能菌株的篩選上注重了秸稈纖維素的降解，因而其作用效果較市售菌劑好。圖2結(jié)果表明，半纖維素含量的變化與纖維素含量的變化成正相關(guān)。CK2和T的半纖維素含量在前6 d分別減少了19.5%和16.7%，在14 d發(fā)酵結(jié)束時(shí)，其降解率分別為28.8%和23.7%，與CK1（8.1%）相比，二者的半纖維素降解率分別高20.7和15.6個(gè)百分點(diǎn)。自制菌劑的處理T的半纖維素降解率明顯高于CK1，且僅比市售腐熟劑的降解率低5.1個(gè)百分點(diǎn)，效果差別不大。說明自制菌劑對(duì)秸稈半纖維素有較好的降解作用。

圖3為發(fā)酵后秸稈木質(zhì)素含量的變化。由圖3可知，木質(zhì)素含量的變化與秸稈重量、纖維素和半纖維素含量的變化呈顯著的負(fù)相關(guān)。處理CK2和T在整個(gè)發(fā)酵過程中，木質(zhì)素含量呈上升趨勢(shì)。在前6 d隨著秸稈重量的迅速減少、秸稈纖維素和半纖維素的較快分解，木質(zhì)素含量的增加也較快，隨后緩慢增加，到發(fā)酵結(jié)束后，處理CK2和T木質(zhì)素含量分別增加了5.47%和6.11%。處理CK1的木質(zhì)素含量基本沒變化，只是在前6 d略有上升。說明在發(fā)酵過程中，自制復(fù)合菌劑和市售菌劑對(duì)秸稈木質(zhì)素幾乎沒有降解作用，這一結(jié)果驗(yàn)證了木質(zhì)素的降解是秸稈木質(zhì)纖維素中最困難的研究報(bào)道[18]。

2.3.2 秸稈失重率的變化 將復(fù)合菌劑以秸稈干重1%的接種量接種到油菜秸稈粉中，測(cè)定秸稈降解率，結(jié)果（圖4）表明，14 d后，不添加菌劑處理CK1、添加市售菌劑處理CK2、添加自制復(fù)合菌劑處理T的秸稈失重率分別為7.5%、33.5%、28.3%。處理T的秸稈重量在前6 d顯著減少，到第6天其秸稈失重率就達(dá)20.4%，6 d后秸稈重量降低幅度不大。處理T與CK2的秸稈重量變化規(guī)律相似，特別是在第8天到整個(gè)發(fā)酵過程結(jié)束，兩處理秸稈的失重率很小，處理T為5.4%，CK2為6.5%，并且變化趨勢(shì)基本一致。說明此次試驗(yàn)自制復(fù)合菌劑與市售菌劑的作用效果差別不大，都能有效啟動(dòng)并加快油菜秸稈的降解。

3 結(jié)論

通過平板篩選以及正交試驗(yàn)篩選纖維素降解菌，篩選出一組高效降解油菜秸稈的復(fù)合菌劑，其CMC酶活性為12 704.3 U/g，F(xiàn)P酶活性達(dá)1 227.7 U/g，秸稈失重率為25.65%，初步鑒定該菌劑組成為地衣芽孢桿菌B4、鏈霉菌A8、米根霉M3和木霉X1。采用此復(fù)合菌劑進(jìn)行油菜秸稈降解特性研究，結(jié)果表明，發(fā)酵前6 d，自制菌劑的秸稈失重率為20.4%，纖維素、半纖維素的降解率分別為16.5%和16.7%；到第14天發(fā)酵結(jié)束時(shí)，其秸稈失重率為28.3%，纖維素和半纖維素的降解率分別為33.1%和23.7%，與市售品牌腐熟劑處理的降解效果相當(dāng)，與無菌劑的對(duì)照比較，自制復(fù)合菌劑的秸稈纖維素、半纖維素降解率分別提高了24.5和15.6個(gè)百分點(diǎn)，秸稈失重率提高了20.8個(gè)百分點(diǎn)，3個(gè)處理對(duì)木質(zhì)素幾乎沒有降解效果。

參考文獻(xiàn)：

[1] 鐘華平，岳燕珍，劉金弟，等.中國作物秸稈資源及其利用[J].資源科學(xué)，2003，25（4）：62-67.

[2] 蘭時(shí)樂，戴小陽，李立恒，等. 油菜秸稈和雞糞高溫堆肥中微生物數(shù)量變化研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（2）：365-368.

[3] 萬楚筠，黃鳳洪，劉 睿，等. 微生物預(yù)處理油菜秸稈對(duì)提高沼氣產(chǎn)量的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2010，26（6）：267-271.

[4] 劉 睿.油料秸稈多菌共同發(fā)酵降解體系的建立及初步應(yīng)用[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009.

[5] 張繼泉，孫玉英，關(guān)鳳梅，等.玉米秸稈纖維素酶解條件的初步研究[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2002（4）：21-23.

[6] 陳小華，朱洪光.農(nóng)作物秸稈產(chǎn)沼氣研究進(jìn)展與展望[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2007，23（3）：279-282.

[7] 陳麗園，夏倫志，吳 東，等.油菜秸稈分解菌的篩選與產(chǎn)酶特性初探[J].中國草食動(dòng)物，2007，27（5）：9-12.

[8] 劉 潔，李憲臻，高培基.纖維素酶測(cè)定方法評(píng)述[J].工業(yè)微生物，1994，24（4）：27-30.

[9] 布坎南 R E，吉布斯 N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].第八版. 中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組，譯.北京：科學(xué)出版社，1984.

[10] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[11] 中國科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，1975.

[12] 阮繼生，劉志恒，梁麗播，等.放線菌研究應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，1990.

[13] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

[14] 咸 芳.餐廚垃圾高效處理復(fù)合微生物菌劑的研究[D].長春：吉林大學(xué)，2009.

[15] 王玉萬，徐文玉.木質(zhì)纖維素固體基質(zhì)發(fā)酵物中半纖維素、纖維素和木素的定量測(cè)定分析程序[J].微生物學(xué)通報(bào)，1987，14（2）：82-84.

[16] 李 華，孔新剛，王 俊.秸稈飼料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的定量分析研究[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（3）：65-68.

[17] 薛惠琴，杭怡瓊，陳 誼.稻草秸稈中木質(zhì)素、纖維素測(cè)定方法的研討[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2001（2）：15.

[18] 牛俊玲，崔宗均，李國學(xué)，等.高效纖維素分解菌復(fù)合系的篩選構(gòu)建及其對(duì)秸稈的分解特性[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2005， 24（4）：795-799.