鎮(zhèn)肝熄風湯預處理對大腦中動脈梗死大鼠腦組織ET－1表達、TNF－α含量及髓過氧化酶活性的影響

吳艷霞，吳婷玉，葉紅，付雷 （武漢第一醫(yī)院，.老年病科，.中心實驗室，湖北 武漢4300）

缺血性腦卒中發(fā)生后，局部急性缺血會刺激ET－1大量表達，而ET－1的過度表達可引起腦組織缺血區(qū) 域 局 部（tumornecrosis factor alpha，TNFα）、細 胞 黏 附 分 子－1（intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1）及白介素8（interleukin－8，IL－8）水平增加，并導致局部單核細胞浸潤［1－2］，局部炎癥反應和及激活相關細胞因子信號通路使血腦屏障受損，介導大量神經(jīng)元死亡，加重腦水腫及腦組織損傷程度。既往研究顯示鎮(zhèn)肝熄風湯可顯著降低腦出血大鼠血漿和腦組織中ET 含量，緩解腦水腫癥狀［3］。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)肝熄風湯具有降低原發(fā)性高血壓大鼠腦組織中ET－1分泌［4］。本實驗在前期研究的基礎上，進一步觀察了鎮(zhèn)肝熄風湯干預大腦中 動 脈 梗 死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠后，對腦組織ET－1 及TNF－α表達以及髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性的影響。從缺血局部炎癥反應角度，分析和探討了鎮(zhèn)肝熄風湯對缺血部位單核細胞活性的調(diào)節(jié)，以及改善局灶性腦缺血組織病理學變化、減輕局部腦水腫的可能機制。

1 材料

TRIzol（GIBCO BRL），M－MLV Reverse Transcriptase、Taq 酶（Promega），QuantiTect SYBR Green RT－PCR Kit（Qiagen Ltd），TNF－α 定 量ELISA 試劑盒（上海森雄科技實業(yè)有限公司）；髓過氧化物酶檢測試劑盒（南京生物建成有限公司）；ET－1 免疫組織化學檢測試劑盒（博士德，批號20101121）。

2 方法

2.1 鎮(zhèn)肝熄風湯制備 懷牛膝30g，代赭石30g，生龍骨15g，生牡礪15g，生龜甲15g，生杭芍15g，玄參15g，天冬15g，川楝子6g，生麥芽6g，茵陳6 g，甘草4.5g組成。藥物由湖北中醫(yī)學院中藥系提供，代赭石、生龍骨、生牡礪、生龜板先煎2h，然后和其余藥物用8倍純化水常規(guī)煎煮3次，過濾，濃縮至生藥1.5g·mL－1和3.0g·mL－1，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 模型制作與分組 清潔級Wistar大鼠120只，體質(zhì)量260～300g［SCXK（鄂）201130002］。雌雄不限，由華中科技大學實驗動物中心提供。模型制作參照Pantoni的線栓法制備MCAO 大鼠模 型［5］。大 鼠 用2%戊 巴 比 妥 鈉 麻 醉（40 mg·kg－1），背位固定于大鼠手術臺，頸部正中切口2～2.5cm，分離二側(cè)甲狀腺，頸上交感神經(jīng)及位于深層的頸內(nèi)動脈最下端分支－翼腭動脈并于分支前1 mm 處結(jié)扎。在頸外動脈距頸總動脈分支約3mm處剪一小口，插入栓塞線，同時將頸外動脈端牽向外下方，使之與頸內(nèi)動脈呈平行走向，拉直與頸內(nèi)動脈的夾角，將栓塞線（日本制尼龍線，直徑0.205 mm）緩緩推入至大腦中腦動脈口，與頸外動脈同時結(jié)扎以固定栓塞線。近心端用另一根縫線結(jié)扎，取下動脈夾，逐層縫合。術中用白熾燈加熱，維持大鼠肛溫37 ℃左右。假手術（Sham）組除僅分離頸內(nèi)外動脈，不閉塞大腦中動脈，其余手術步驟同模型組。將實驗大鼠隨機分組：（1）A 組：假手術組；（2）B組：模型組；（3）C 組：小劑量鎮(zhèn)肝熄風湯干預組（15g·kg－1）；（4）D 組：大劑量鎮(zhèn)肝熄風湯 干 預 組（30g·kg－1）。其 中C、D 組 大 鼠 于MCAO 術前14天給予不同劑量鎮(zhèn)肝熄風湯灌胃，A、B組大鼠給予純化水灌胃。每100g體質(zhì)量給1mL，分2次灌服，共14d。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄反應 收集各組缺血腦組織，用Trizol一步法提取組織總RNA，取1μg組織總RNA ，加入Oligo primer（0.5mg·mL－1）1μL，去離子水12 μL 混勻，70 ℃預熱5min。0 ℃冰水浴立刻終止，5 000r·min－1離心4s。加入5×reaction buffer 4 μL Ribonuclease 酶抑制劑（20 U·μL－1）1μL 、dN TPs（10μmol·L－1）2μL 混勻，37 ℃放置5 min，再加Reverse Transcriptase（200 U·μL－1）1 μL，42 ℃下放置60min，再70 ℃預熱10min。0℃終止后，cDNA－20 ℃凍存。

2.4 熒 光 定 量 檢 測ET－1 的mRNA 表 達 采 用SYBR Green熒光染料法針對ET－1mRNA 進行實時RT－PCR 檢測，緩沖液10μL、ddH2O 4μL、ROX熒光染料1μL，預變性95℃10s、94℃20s，56℃15s延伸72℃15s，45次循環(huán)，72℃5min。設置陰性對照和β－actin 內(nèi)參照，引物序列：F 5′－TCTTCTCTCTGCTGTTTGTGGCTT－3′，R 5′－TCTT TTACGCCTTT－CTGCATGGTA－3′。

2.5 免疫組織化學法檢測ET－1分布及表達 收集各組缺血腦組織，切除部分端腦組織，置4%多聚甲醛固定、脫水、包埋后進行切片，采用SABC 法，以PBS 代替一抗作陰性對照。ET－1蛋白檢測I抗（兔抗大鼠ET－1）、Ⅱ抗（生物素標記山羊抗兔lgG）。染色步驟按照免疫組化試劑盒說明進行。結(jié)果判定：陽性反應為深棕色顆粒，每張切片在400倍顯微鏡視野下隨機選取缺血區(qū)5個不重疊視野計數(shù)ET－1陽性細胞數(shù)。陰性對照，染色時不加入一抗，結(jié)果為陰性。

2.6 ELISA 法檢測腦組織TNF－α含量 收集各組缺血腦組織，研磨成勻漿，加0.1moL·L－1磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）至5 mL，離心3 000r·min－1×3 min，取上清液進行檢測。采用EL ISA 法檢測上清液TNF－α的含量。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.7 分光光度法檢測MPO 活性 收集各組缺血腦組織，稱取濕重后勻漿并4 ℃離心（12 000×g，10 min），參照Weston等方法［2］及試劑盒說明，采用分光光度法，于460nm 波長檢測缺血側(cè)腦組織MPO活性。

3 結(jié)果

3.1 鎮(zhèn)肝熄風湯對缺血腦組織ET－1的mRNA 水平的影響 各組缺血腦組織ET－1 及空白對照組mRNA 的濃度，經(jīng)t檢驗，結(jié)果顯示模型組（A 組）大鼠缺血側(cè)腦組織ETmRNA 表達量較假手術組（B組）大鼠有極顯著的增加（P＜0.01）；大劑量鎮(zhèn)肝熄風湯（D 組）預先使用可明顯降低MCAO 大鼠缺血側(cè)腦組織ETmRNA 表達量（P＜0.05）。見圖1。

3.2 鎮(zhèn)肝熄風湯對缺血腦組織ET－1的蛋白水平的影響 免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，與假手術組（A 組）相比，MCAO 模型組（B 組）大鼠缺血側(cè)腦組織中ET－1陽性細胞表達顯著升高（P＜0.01）；鎮(zhèn)肝熄風湯高、低劑量干預組（C、D 組）MCAO 大鼠缺血側(cè)腦組織中ET－1陽性細胞表達下降且與模型組相比差異具有極顯著性（P＜0.01）。見圖2，表1。

圖1 鎮(zhèn)肝熄風湯對MCAO 大鼠缺血側(cè)腦組織ET－1mRNA 表達的影響（n＝8，real－time RT－PCR）A：假手術組；B：模型組；C：小劑量鎮(zhèn)肝熄風湯組；D：大劑量鎮(zhèn)肝熄風湯組（注：與模型組相比，aP＜0.05，b P＜0.01）Fig 1 Effect of Zhengan Xifeng decoction on the expression of ET－1mRNA in MCAO ischemirats rats brain tissue（n＝8，real－time RT－PCR）A.sham operation group；B.model group；C.a small dose of Zhengan Xifeng decoction group；D.large dose of Zhengan Xifeng decoction group（Note：compared with model group，aP＜0.05，b P＜0.01）

3.3 鎮(zhèn)肝熄風湯對缺血腦組織TNF－α 含量及MPO 濃度的的影響 ELISA 檢測TNF－α含量結(jié)果顯示，與假手術組（A 組）相比，MCAO 模型組（B組）大鼠缺血側(cè)腦組織中TNF－α含量顯著升高（P＜0.05）；鎮(zhèn)肝熄風湯高量干預組（D 組）MCAO 大鼠缺血側(cè)腦組織中TNF－α含量下降且與模型組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 鎮(zhèn)肝熄風湯對MCAO 大鼠缺血側(cè)腦組織ET－1蛋白表達的影響（SABC，×400）A：假手術組；B：模型組；C：小劑量鎮(zhèn)肝熄風湯組；D：大劑量鎮(zhèn)肝熄風湯組Fig 2 Effect of Zhengan Xifeng decoction on ET－1protein expression in MCAO ischemic rats brain tissue（SABC，×400）A.sham operation group；B.model group；C.a small dose of Zhengan Xifeng decoction group；D.large dose of Zhengan Xifeng decoction group

為了評價大鼠MCAO 后缺血側(cè)腦組織中單核細胞的活化程度，我們檢測了MPO 的濃度，作為判斷單核細胞活化程度的指標。結(jié)果顯示假手術組（A 組）腦組 織 中MPO 濃 度 很 低，模 型 組（B 組）缺血側(cè)腦組織中MPO 的濃度較假手術組顯著升高（P＜0.01），而不同劑量鎮(zhèn)肝熄風湯干預組（C、D 組）MPO 濃度較模型組均有明顯降低（P＜0.05），其中又以大劑量鎮(zhèn)肝熄風湯干預組MPO 濃度降低最為顯著（P＜0.01），見表1。

表1 鎮(zhèn)肝熄風湯對MCAO 大鼠缺血腦組織ET－1 蛋白TNF－α含量及MPO 濃度的影響（±s，n＝8）Tab 1 Effect of Zhengan Xifeng decoction on ET－1protein expression，TNF－αcontent and MPO concentration in MCAO ischemic rat brain tissue（±s，n＝8）

表1 鎮(zhèn)肝熄風湯對MCAO 大鼠缺血腦組織ET－1 蛋白TNF－α含量及MPO 濃度的影響（±s，n＝8）Tab 1 Effect of Zhengan Xifeng decoction on ET－1protein expression，TNF－αcontent and MPO concentration in MCAO ischemic rat brain tissue（±s，n＝8）

注：與模型組相比，aP＜0.05，b P＜0.01

4 討論

ET 主要由血管內(nèi)皮細胞合成分泌，是目前已知最強的縮血管物質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛的分布，腦內(nèi)ET 主要分布于下丘腦、大腦皮質(zhì)、紋狀體和側(cè)腦室等組織［6－7］。生理狀態(tài)下，低濃度的ET－1可選擇性地激動ETB受體，使腦血管擴張，參與腦部血流的調(diào)節(jié)；在腦缺血發(fā)生極早期，局部組織ET－1高度表達是機體調(diào)節(jié)局部血液供應的重要病理生理機制，但是，局部高濃度的ET－1可通過激動ETA受體使腦血管產(chǎn)生強烈、長時間的收縮，加重局部缺血反應，使用ETA受體抑制劑后可明顯減少腦缺血后的神經(jīng)元損傷［6，8］。本實驗結(jié)果顯示，與假手術組相比，MCAO 模型組大鼠在腦缺血6h后，缺血側(cè)腦組織中ET－1mRNA 及其蛋白質(zhì)表達有顯著性升高，并與腦梗死面積和腦水腫程度呈正比，這與Barone等［9］研究結(jié)果一致，而鎮(zhèn)肝熄風湯高、低劑量干預組MCAO 大鼠缺血側(cè)腦組織中ET－1表達量均有不同程度下降，且鎮(zhèn)肝熄風湯對ET－1表達的抑制是從轉(zhuǎn)錄水平上進行的。

據(jù)報道，腦缺血急性期缺血區(qū)域組織缺血、缺氧及細胞壞死，一方面可直接激活局部炎癥反應，另一方面急性缺血引起的ET－1高度表達可通過激活炎性細胞因子TNF－α介導中性粒細胞而參與局部炎癥反應，從而使血腦屏障受損，加劇了腦缺血性損害及腦水腫［10］。在本次實驗中，我們發(fā)現(xiàn)與Juergens等［10］研究結(jié)果類似，在腦局部缺血6h 后，MCAO模型組大鼠腦組織TNF－α含量及單核細胞的活化程度，伴隨著腦組織ET－1表達量的增加而增加，而預先使用鎮(zhèn)肝熄風湯14d后，發(fā)生局部腦缺血大鼠腦組織中TNF－α含量及單核細胞活化程度與模型組相比顯著降低。由于ET－1在腦缺血發(fā)生極早期的高度表達可過度激活TNF－α分泌并募集、活化局部中性粒細胞，而鎮(zhèn)肝熄風湯具有明顯的抑制ET－1表達的作用，因此，抑制ET－1高度表達引起的局部炎癥反應可能是鎮(zhèn)肝熄風湯發(fā)揮對腦梗死的防治作用的主要分子機制。

就臨床而言，缺血性腦卒中病理性質(zhì)多屬本虛標實，肝腎陰虛、氣血衰少為致病之本，風、火、痰、氣、淤為發(fā)病之標?，F(xiàn)代中醫(yī)證候研究發(fā)現(xiàn)，證候是疾病發(fā)生發(fā)展過程中不同階段的機體整體反應，是一個動態(tài)演變過程，在缺血性腦卒中的急性期、慢性期或恢復期等階段均存在不同主要證候［11］，臨床研究發(fā)現(xiàn)，火證、淤證和痰證可能是中風急性期主要改變［12］，而中風之火證、淤證和痰證等又與病理狀態(tài)下人體免疫系統(tǒng)及凝血系統(tǒng)等異常反應密切相關。急性局部腦缺血時過度的ET－1、TNF－α等類炎性／炎性細胞因子表達，局部活化的炎癥反應及出、凝血反應等可能均屬于中醫(yī)淤、痰證范疇。鎮(zhèn)肝熄風湯具有“重在鎮(zhèn)逆，治本圖緩、剛?cè)嵯酀钡奶攸c，張錫純在立方時即已認識到中風急性發(fā)作時肝陽上亢、肝風內(nèi)動與氣血上逆互為因果，治宜平肝潛降，引氣血下行，兼顧滋潤肝腎?，F(xiàn)代臨床及實驗研究亦顯示其具有調(diào)節(jié)血脂［13］，改善絕經(jīng)后動脈粥樣硬化患者血管內(nèi)皮功能［14］等功能作用。因此，通過預防性使用鎮(zhèn)肝熄風湯可以調(diào)節(jié)機體在應激環(huán)境下的反應狀態(tài)，抑制缺血性腦卒中急性發(fā)作時淤、痰等病理產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而達到改善缺血性腦卒中急性期組織損傷的作用。

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