pH 敏感型紫杉醇膠束的工藝優(yōu)化

劉佳，許建國，張燦 （.江蘇省蘇北人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 揚州，500；.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京0009）

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是一類具有抗微管作用機理的廣譜細胞毒類抗癌藥，目前廣泛應(yīng)用于對卵巢癌、乳腺癌、頭頸部癌、非小細胞性肺癌及前列腺癌的治療中。臨床常用制劑是以聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇為混合溶劑的紫杉醇的油溶液。該制劑中的聚氧乙烯蓖麻油靜注后會引起嚴重的毒副作用，如過敏、神經(jīng)毒性等［1］。

聚合物膠束已經(jīng)成了藥物傳遞系統(tǒng)研究領(lǐng)域的一個熱門，它由兩親性的高分子材料在水環(huán)境中自組裝形成、具有均一納米級粒徑及球形的核殼結(jié)構(gòu)納米粒［2］。張燦課題組報道了多種殼聚糖衍生物膠束用于增溶難溶性藥物，其中以N－辛基為疏水鏈，酰胺鍵連接的環(huán)己烷二甲酸為親水鏈修飾連接在殼聚糖主鏈上合成了一系列pH 敏感的兩親性衍生物N－辛基－N’－（2－羧基環(huán)己甲?；瓪ぞ厶牵∣CCC）。將其溶于水中可自發(fā)形成具有殼核結(jié)構(gòu)的膠束，而且通過酰胺鍵連接的親水外層在正常生理環(huán)境（pH 7.4）下穩(wěn)定存在，通過EPR（enhanced permeability and retention effect，高通透性和滯留效應(yīng)）效應(yīng)到達腫瘤組織進入內(nèi)涵體或溶酶體后，弱酸性環(huán)境（pH 5.0～6.0）使連接臂發(fā)生水解，膠束外殼的親水部分斷裂，膠束結(jié)構(gòu)被破壞并迅速釋放出藥物，達到提高治療藥物胞內(nèi)濃度的目的，從而實現(xiàn)腫瘤治療的有效性和安全性。前期研究表明膠束在正常生理環(huán)境下穩(wěn)定，而在微酸性環(huán)境下敏感，細胞毒研究表明其為無毒和安全的藥物載體［3］。

中心面復(fù)合設(shè)計優(yōu)化法（central composite design，CCD），是一種多元非線性擬合的實驗設(shè)計方法，根據(jù)非線性數(shù)學(xué)模型描繪效應(yīng)面優(yōu)選條件，故而模型具有精度高，預(yù)測性較好的特點［4］。因此，本實驗采用此法優(yōu)選pH 敏感型紫杉醇膠束的處方。

1 材料

N－辛基－N’－（2－羧基環(huán)己甲?；瓪ぞ厶牵撘阴６?7%，辛基取代度36%，自制， 批號20090805）；紫杉醇（江蘇紅豆杉生物科技有限公司，99.66%，批號20090528）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；重蒸水（自制）；其他化學(xué)試劑均為分析純。

微孔濾膜（上海新亞凈化器件廠）；透析袋（截留相 對 分 子 質(zhì) 量10 kDa，Sigma－Aldrich 公 司）；H66025T 型超聲儀（無錫電子設(shè)備廠）；電子天平（北京塞多利斯天平有限公司）；Agilent 1050色譜儀（美國Agilent公司）；Zetasizer 3000HSA 粒徑電位儀。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫杉醇膠束制劑的制備與含量測定 采用透析法制備紫杉醇膠束［5］。OCCC和紫杉醇分別溶于去離子水和無水乙醇中，隨后在磁力攪拌下（室溫，500r·min－1）將紫杉醇的乙醇液逐滴加入至OCCC的水溶液中，所得乳白色溶液加入透析袋中（截留相對分子質(zhì)量10kDa）隨后在去離子水中透析，分別過0.8，0.45，0.22μm 的微孔濾膜。濾液加入5%的甘露醇為保護劑后凍干，凍干樣品在4 ℃下避光保存。用馬爾文粒徑儀，633nm 的He－Ne光在25℃下測定得到膠束的粒徑和Zeta電位。

HPLC法測定得到膠束的載藥量（drug loading rate，DL）和 包 封 產(chǎn) 率（entraptment efficiency，EE）。液相色譜條件為：色譜柱Lichrospher C18（4.6mm×250mm，5μm，江蘇漢邦）；流動相甲醇－水為75∶25（v／v）；流速1mL·min－1；柱溫25 ℃；進樣量20μL；檢測波長227nm。吸取一定量的膠束溶液用流動相稀釋50倍后進樣測含量。標準曲線：C＝2.49×10－2A＋1.299 7，r＝0.999 9，線性范圍10.0～100.0μg·mL－1。標準曲線的日間、日內(nèi)RSD 均小于10%，精密度良好。載藥量（DL）和包封產(chǎn)率（EE）的計算公式為：

mPTX1：被載入膠束的紫杉醇質(zhì)量，mOCCC：載藥時投入的OCCC質(zhì)量，mPTX2：載藥時投入的紫杉醇質(zhì)量。

2.2 單因素試驗 影響膠束載藥的因素很多，首先對這些因素進行了篩選。選擇膠束的載藥量，包封產(chǎn)率，粒徑以及多分散指數(shù)（polydispersity index，PI）為考察指標，比較不同因素水平對含量的影響。當(dāng)改變某一因素水平時其他因素保持不變，如果各考察指標在該因素不同水平下沒明顯變化，則認為該因素?zé)o影響將其去除。

2.2.1 藥載比（PTX／OCCC，w／w）的影響 配制溶度為50mg·mL－1的紫杉醇乙醇溶液和濃度為6 mg·mL－1的OCCC溶液。在磁力攪拌下，分別吸取0.09，0.135，0.18，0.27，0.315，0.36，0.45mL紫杉醇溶液（藥載比分別是0.3，0.45，0.6，0.75，0.9，1.05，1.2，1.5）滴加入2.5mL 載體溶液中，每個藥載比制備3份樣品，按“2.1”項下方法制備和測定含量，計算載藥量及包封產(chǎn)率，用粒徑儀測定膠束粒徑及多分散指數(shù)。

膠束的載藥量、包封產(chǎn)率、粒徑以及多分散指數(shù)的變化如圖1所示。

隨著藥載比升高，膠束的載藥量和包封產(chǎn)率逐漸增大，且粒徑逐漸減小，多分散指數(shù)變化不大，但藥載比大于1.05后，載藥量及包封產(chǎn)率開始下降，而且粒徑和多分散指數(shù)也顯著升高。這可能是因為材料疏水內(nèi)核對藥物的容納能力有限，藥載比為0.3，0.45，0.6時其包封產(chǎn)率沒有顯著性差異，當(dāng)藥載比大于1.05時，包封產(chǎn)率開始下降，說明藥載比為1.05時載體達到了載藥飽和能力。

圖1 藥載比（PTX／OCCC，w／w）對膠束（a）載藥量和包封產(chǎn)率以及（b）粒徑和PI的影響（n＝3）Fig 1 Effect of different ratios of PTX／OCCC（w／w）on micelle（a）DL and EE（b）size and PI（n＝3）

2.2.2 OCCC 載體濃度的影響 配制質(zhì)量濃度為3.0，6.0，9.0，12.0，15.0 mg·mL－1的OCCC 載 體溶液和50mg·mL－1的紫杉醇乙醇液，在磁力攪拌下，分別吸取0.15，0.3，0.3，0.45，0.60，0.75mL的藥物溶液逐滴滴加入2.5mL載體溶液中，每個藥載比制備3 份樣品，按“2.1”項下方法制備和測定含量，計算載藥量及包封產(chǎn)率，用粒徑儀測定膠束粒徑及多分散指數(shù)。所得結(jié)果如圖2所示。

圖2 載體濃度對膠束（a）載藥量和包封產(chǎn)率以及（b）粒徑和PI的影響（n＝3）Fig 2 Effect of different concentration of OCCC on micelle（a）DL and EE（b）size and PI（n＝3）

隨著載體濃度的升高載藥量和包封產(chǎn)率逐漸上升，在6.0mg·mL－1時達到最大，以后載藥過程中有紫杉醇泄露導(dǎo)致載藥量和包封產(chǎn)率迅速下降。而粒徑和多分散指數(shù)也顯著變化，隨著載體濃度的升高，粒徑和PI逐漸增大，但是大于6.0mg·mL－1時，由于載藥過程中膠束的泄露和破壞，膠束粒徑和多分散指數(shù)顯著增加，濃度更高時無法測定。這可能由于濃度高的載體溶液中，聚合物單體大量增加，這時溶液為維持體系的穩(wěn)定開始形成膠束的二次聚集［6］，隨著濃度的增加粒徑顯著增加的變化也證實了這點，而這不利于形成球形的膠束因此不能穩(wěn)定載藥。

2.2.3 藥物濃度的影響 配制質(zhì)量濃度為30，40，50，60，70 mg·mL－1紫杉醇的乙醇溶液和6 mg·mL－1的OCCC 溶液。在磁力攪拌下，分別吸取0.5，0.375，0.3，0.25，0.214mL藥物溶液逐滴滴加入2.5mL載體溶液中，每個藥載比制備3份樣品按“2.1”項下方法制備和測定含量，計算載藥量及包封產(chǎn)率，用粒徑儀測定膠束粒徑及多分散指數(shù)。

所得結(jié)果如圖3所示。

圖3 藥物濃度對膠束（a）載藥量和包封產(chǎn)率以及（b）粒徑和PI的影響（n＝3）Fig 3 Effect of different concentration of PTX on micelle（a）DL and EE（b）size and PI（n＝3）

結(jié)果表明，當(dāng)紫杉醇質(zhì)量濃度為30mg·mL－1時膠束載藥失敗，推測是由于藥物溶液中的乙醇量比較多，透析過程中不易除去使得載藥失敗；隨著濃度的增加載藥量和包封產(chǎn)率逐漸上升，粒徑和多分散指數(shù)也逐漸下降，達到50mg·mL－1后沒有顯著變化，因此選用紫杉醇質(zhì)量濃度為50mg·mL－1后期進行處方優(yōu)化。

2.2.4 透析時間的影響 配制6.0 mg·mL－1的OCCC載體溶液和50 mg·mL－1的紫杉醇乙醇液，在磁力攪拌下，將藥物溶液逐滴加入至2.5mL的載體溶液中，混合后分別透析6，12，24，36h后分別過0.8，0.45，0.22μm 微孔濾膜，每個時間點制備3份樣品同“2.1”項測PTX 含量和粒徑及PI，計算載藥量和包封產(chǎn)率。結(jié)果如圖4所示。

圖4 透析時間對膠束（a）載藥量和包封產(chǎn)率以及（b）粒徑和PI的影響（n＝3）Fig 4 Effect of dialysis time on micelle（a）DL and EE（b）size and PI（n＝3）

由圖可知，6h之后隨著透析時間的增加，膠束的載藥量、包封產(chǎn)率、粒徑以及多分散指數(shù)無顯著性差異，說明6h之后的透析時間對膠束無明顯影響，選擇透析時間為6h。

2.3 中心復(fù)合面設(shè)計優(yōu)化處方 在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇對紫杉醇膠束包封產(chǎn)率、載藥量影響顯著的2個因素，藥載比（A）和載體濃度（B）作為考察對象，載藥量（DL%）（Y1）和包封產(chǎn)率（EE%）（Y2）為評價指標，利用Design Expert 8.0軟件，通過中心復(fù)合設(shè)計進行實驗設(shè)計［7］，各因素水平代碼和具體物理量見表1。應(yīng)用Design Expert 8.0，對藥載比和載體濃度這2個自變量進行實驗設(shè)計安排結(jié)果如表2。

表1 考察因素各水平的代碼值及實際操作物理量Tab 1 Independent variables and their correspondent values in code and physical form

表2 實驗設(shè)計安排及各考察指標的結(jié)果Tab 2 Experiment design and results

評價指標（Y1和Y2）分別對自變量（A 和B）進行多元線性擬合和多元非線性擬合，以相關(guān)系數(shù)r2和方差分析中的顯著性水平P 來評定模型的優(yōu)度，r2越大，P 越小，模型擬合情況越好。根據(jù)模型擬合得到的方程分別繪制2個指標對自變量的三維效應(yīng)面圖。

單量化指標的優(yōu)化可以根據(jù)結(jié)果直接進行判斷，但當(dāng)指標超過一個時，指標間往往相互影響，對某一項指標有利的條件可能不利于另一個指標，最終選擇條件往往根據(jù)這些指標的綜合效應(yīng)。我們引入“總評歸一值”（overall desirability，OD）的概念，每個指標均標準化為0～1之間的“歸一值”，各指標的“歸一值”求幾何平均數(shù)，得“總評歸一值”。公式如下［8－9］：

對取值越大越好的因素（如包封產(chǎn)率、載藥量），采用Hassan方法進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化求“歸一值”di，公式如下［8，9］：

以O(shè)D 對2個自變量進行擬合繪制三位效應(yīng)面圖，選取最優(yōu)處方。按最有處方制備紫杉醇膠束，并進行預(yù)測分析。用多元線性模型對各評價指標和自變量（A 和B）進行回歸，其方程如下：

用多元非線性模型對各評價指標和自變量進行回歸，各擬合的二次多項式方程為：

擬合結(jié)果表明，以二次多項回歸方程的相關(guān)系數(shù)r高，相關(guān)性最好，根據(jù)擬合得到的二次多項式方程繪制三維效應(yīng)面圖，如圖5 所示，分別為藥載比（A）和載體濃度（B）對載藥量（Y1）和包封產(chǎn)率（Y2）的三維效應(yīng)面圖。從圖中可以直觀地觀察到最優(yōu)區(qū)域，得到的最優(yōu)處方為藥載比為0.98，載體質(zhì)量濃度為3.0mg·mL－1。

圖5 載藥量（Y1），包封產(chǎn)率（Y2）和OD 值對藥載比（A），載體濃度（B）的效應(yīng)面圖Fig 5 The predicted response surface of the drug loading（Y1），entrapment efficiency（Y2）and OD function of drug／carrier（A）and carrier concentration（B）

根據(jù)所得最優(yōu)處方，透析法制備紫杉醇膠束，測定載藥量和包封產(chǎn)率，同時與預(yù)測值進行對比分析，結(jié)果見表3。

表3 PTX－膠束的預(yù)測和實測結(jié)果分析Tab 3 Predicted and measured values of PTX－loaded OCCC micelle

由表3可見，按照擬合得到的最優(yōu)處方制得的紫杉醇膠束，載藥量和包封產(chǎn)率與預(yù)測值很接近，偏差在規(guī)定范圍內(nèi)，表明模型預(yù)測較準確。以上優(yōu)化得到了PTX－OCCC 膠束的最優(yōu)工藝為：精密稱取29.4mg PTX 溶于0.58mL 的無水乙醇中，OCCC載體30.0mg 溶于10mL的去離子水中，磁力攪拌下將PTX 乙醇液緩慢滴加入載體水溶液中，混合后于25 ℃下去離子水透析6h 后分別過0.8，0.45，0.22μm 微孔濾膜，得到pH 敏感型膠束的載藥量為（34.8±2.5）%，包封產(chǎn)率為（69.8±4.4）%。粒徑為（142.5±4.4）nm，Zeta電位為（－23.5±1.2）mV。

2.4 膠束凍干品的配伍穩(wěn)定性 紫杉醇膠束凍干品與臨床常用的5%葡萄糖溶液，0.9%生理鹽水的配伍穩(wěn)定性進行初步性考察。紫杉醇膠束凍干粉分別以5%葡萄糖溶液、0.9%生理鹽水溶液稀釋，置室溫、自然光下于0，2，4，6，8h取樣，測定其中藥物含量、粒徑、Zeta電位。含量以0h時間點溶液中的紫杉醇含量為100%，計算其他時間點相應(yīng)溶液中的紫杉醇百分含量，計算出泄漏率。泄漏率按如下公式計算：

泄漏率＝（1－凍干后膠束中藥物濃度／凍干前膠束中藥物濃度）×100%

以粒徑和PTX 泄漏率為考察指標評價膠束與常用輸液5%葡萄糖溶液、0.9%生理鹽水在8h內(nèi)的配伍穩(wěn)定性，結(jié)果見表4，膠束凍干粉用5%葡萄糖和0.9%生理鹽水復(fù)溶后粒徑均無明顯改變，但是用葡萄糖復(fù)溶的膠束中PTX 含量偏低，這可能與臨床輸液的pH 不同有關(guān)，5%葡萄糖溶液的pH 值為3.2～5.5，而0.9%生理鹽水的pH 值為5.5～7.4，低pH 值的輸液可能導(dǎo)致pH 敏感的膠束不穩(wěn)定。因此建議臨床使用時用0.9%生理鹽水與之配伍。

3 討論

近年來新型給藥系統(tǒng)處方篩選和工藝優(yōu)化主要以星點復(fù)合設(shè)計（CCD）的應(yīng)用較多，根據(jù)星點設(shè)計所建立的數(shù)學(xué)模型描繪效應(yīng)面，將各效應(yīng)面的等高線進行重疊直接得到了較佳區(qū)域，直觀方便地確定了較優(yōu)處方。多個效應(yīng)所選擇的較佳條件通過疊加，可以進一步縮小較佳條件范圍。若無重疊區(qū)時，可通過歸一化，求總評“歸一值”的方法進行綜合評價。

表4 PTX－膠束凍干品與5%葡萄糖和0.9%生理鹽水的配伍穩(wěn)定性Tab 4 The compatible stability of PTX micelle with 5%glucose infusion solution and 0.9%normal saline solution

研究結(jié)果表明，中心面復(fù)合設(shè)計適用于pH 敏感型紫杉醇膠束的工藝優(yōu)化，所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性良好，PTX 膠束具有較高的載藥量和包封產(chǎn)率。配伍穩(wěn)定性研究表明膠束凍干品用pH 近中性的生理鹽水復(fù)溶后穩(wěn)定性好。制備過程中膠束溶液過微孔濾膜目的是為了濾除粒徑過大的膠束使粒徑分布趨于均一，這樣保證所得膠束的粒徑是納米級別，有利于減少膠束進入體內(nèi)后被RES系統(tǒng)攝取，延長體循環(huán)時間從而實現(xiàn)被動靶向作用，膠束較高的Zeta電位值使得膠束粒子互相排斥從而增強膠束在循環(huán)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性。

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