吡格列酮改善2型糖尿病大鼠腦內(nèi)胰島素抵抗以及阿爾茨海默病樣tau蛋白磷酸化＊

姜 騰， 胡蜀紅， 楊 雁， 楊思思

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430030

2型糖尿?。╰ype 2diabetes，T2D）是最常見的內(nèi)分泌代謝病，中國20歲以上成人糖尿病患病率已高達9.7%［1］。隨著治療水平的提高，T2D 患者帶病生存時間延長，然而認知功能損害和癡呆成為新的并發(fā)癥。阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，占成人癡呆癥的60%～80%［2］。流行病學資料顯示，T2D 人群發(fā)生遲發(fā)型阿爾茨海默病的風險較非T2D 人群增加1.4～4.3倍［3－4］。因此，探討T2D 患者AD 發(fā)病風險增高的原因和尋求藥物治療靶點具有重要意義。

AD 患者最典型的臨床表現(xiàn)是記憶力進行性減退，海馬組織中tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)和淀粉樣β蛋白（amyloidβ－protein，Aβ）聚集形成老年斑被認為是AD 的特征性病理改變［5］。大腦內(nèi)胰島素可改善記憶和認知功能，大腦胰島素缺乏或敏感性下降可導致AD。研究證實，AD 病變與大腦胰島素水平的異常以及胰島素信號轉(zhuǎn)導的變化密切相關(guān)［6］。大腦內(nèi)的胰島素主要來源于外周血液，在外周，胰島素主要發(fā)揮促進合成、維持血糖濃度穩(wěn)定的作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，胰島素主要作為一種神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，與胰島素受體結(jié)合之后通過影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和重攝取來調(diào)控突觸可塑性及促進記憶、學習和認知功能［7］。非糖尿病AD 患者與正常人比較，外周胰島素水平并無變化，但大腦胰島素水平顯著降低，反映AD 患者腦內(nèi)存在明顯的胰島素攝取或分泌缺陷，大腦胰島素大多為外周胰島素通過血腦屏障進入［8］。在對大鼠腦室注射鏈脲佐菌素STZ后，大鼠會出現(xiàn)認知功能減弱，其原因在于胰島素信號傳導減弱［9］。而經(jīng)對上述大鼠腦室注射胰島素類似物后，大鼠認知功能得到相應恢復［10］。AD 小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）后（1型糖尿病模型）導致外周胰島素缺乏，大腦內(nèi)胰島素水平進一步下降，檢測發(fā)現(xiàn)小鼠大腦出現(xiàn)AD 樣改變：Aβ沉積及tau蛋白過度磷酸化加重［11］。這些研究說明，大腦胰島素缺乏與AD 樣病變的形成密切相關(guān)。T2D時外周胰島素水平增高，大腦胰島素水平是否也如血漿中胰島素水平一樣升高，尚不明了。

噻唑烷二酮（thiazolidinedione，TZD）是迄今為止作用最強的選擇性過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator－activated receptor－γ，PPARγ）激動劑，作為一種胰島素增敏劑能改善外周胰島素抵抗并降低血糖水平，被廣泛應用于治療T2D。研究發(fā)現(xiàn)TZD 類藥物吡格列酮（Pioglitazone）能改善AD 患者認知功能［12］，吡格列酮能否改善腦內(nèi)胰島素抵抗，減輕AD 樣病變尚未見報道。

本研究以T2D 大鼠為研究對象，測定腦脊液和血漿胰島素水平、大腦及外周組織（肝臟）胰島素信號轉(zhuǎn)導途徑中PI3K／Akt／GSK－3β的活性來評估胰島素抵抗程度。同時檢測大腦海馬磷酸化tau蛋白水平判斷糖尿病大鼠腦AD 樣病變的程度，分析糖尿病大鼠腦內(nèi)胰島素抵抗與AD 樣病變的關(guān)系。此外，采用胰島素增敏劑吡格列酮干預T2D 大鼠，觀察上述指標的變化以探討胰島素增敏劑能否改善T2D 大鼠腦內(nèi)胰島素抵抗以及減少AD 樣病變的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 T2D大鼠模型的制備

雄性SD 大鼠（華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供）21 只，體重150～180g，10～12 周齡，隨機分為3 組，每組7 只，分別為正常對照組（CTL），2型糖尿病非干預組（T2D），2型糖尿病吡格列酮干預組（PIO）。T2D 組和PIO 組給予高脂高糖高蛋白飲食［熱卡百分比為碳水化合物26.0%，蛋白質(zhì)15.2%，脂肪（煉豬油）58.8%］3個月后，按照30～35 mg／kg劑量腹腔1次性注射鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）（Sigma，粉劑溶于0.1 mol／L pH 4.3 檸檬酸鈉緩沖液中），72h后尾靜脈取血，血糖儀（強生穩(wěn)豪）測血糖≥16.7mmol／L、尿糖持續(xù)陽性為造模成功。CTL 組給予普通飲食喂養(yǎng)，并按照上述方法尾靜脈注射檸檬酸緩沖液。

1.2 吡格列酮干預

PIO 組用吡格列酮片（吡格列酮片由日本武田公司提供）按照每天20mg／kg灌胃4 周，T2D 組及CTL組同等劑量生理鹽水灌胃4周，4周后斷頸處死所有實驗動物。實驗過程中，大鼠單籠飼養(yǎng)于恒溫（25℃）的清潔級動物房中，每天光照12h，天黑前投食，自由飲水。處死前各組大鼠數(shù)目：CTL組5只，T2D 組5只，PIO 組5只。

1.3 血糖測定

處死前由尾靜脈采血，用血糖儀（強生穩(wěn)豪）檢測血糖水平。

1.4 血漿胰島素測定

處死前心臟取血1mL，離心后取血漿，－20℃保存，放免法一次性檢測。藥盒購自北京中科院原子能科學研究所，測定值批內(nèi)CV＜2.5%，批間CV＜3.5%。

1.5 胰島素抵抗指標

胰島素抵抗指標以穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗指數(shù)HOMA－IR＝FINs（mU／L）×FPG（mmol／L）／22.5表示［13］，F(xiàn)INs為（空腹胰島素濃度），F(xiàn)PG 為（空腹血糖濃度）。

1.6 腦脊液胰島素測定

參照H?istad等［14］的方法，運用20%的烏拉坦將大鼠麻醉以后，剪開頭部皮膚，清理組織和肌肉，暴露小腦及延髓部，運用注射器針頭在腦膜上開孔，向內(nèi)插入細管，將細管末端低于頭部，等待腦脊液自動流出，收集20～50μL用放免法檢測腦脊液胰島素水平。

1.7 Western blot檢測

處死動物，取出一側(cè)大腦海馬組織、肝臟組織及肌肉組織。分別放入勻漿器內(nèi)，加入蛋白質(zhì)提取液，冰上勻漿。蛋白質(zhì)提取液為40mmol／L Tris－HCl，pH 7.0，1%Triton X－100，0.2%SDS，1.0 mmol／L脫氧膽酸鈉，1.0 mmol／L Na3VO4，50 mmol／L NaF，1.0 mmol／L PMSF，2.0 mg／L 的aprotinin、leupeptin、pepstatin，1.0 mmol／L EGTA，及1.0 mmol／L EDTA（以上試劑購自武漢凌飛科技公司）。于4℃離心機內(nèi)12 000g離心10min，取上清即為蛋白質(zhì)。取10μL 用Bradford法檢測蛋白質(zhì)濃度，余儲存于－80℃冰箱備用。用前加2×樣本緩沖液并混勻，于100℃變性5min。在垂直電泳槽內(nèi)每孔內(nèi)加入約10～30μg蛋白，10%SDS－PAGE電泳，結(jié)束后全濕轉(zhuǎn)至NC 膜。搖床上5%BSA 封閉2h；雜交一抗（所有抗體如表1 所示）4℃過夜；PBST 洗膜3次，每次10min；雜交二抗（辣根酶標記的羊抗兔、羊抗鼠及兔抗羊IgG 購自PIERCE 試劑公司），室溫搖床上1h；PBST 洗膜3次，每次10 min；ECL顯色，最后用膠片感光。運用BandScanV 5.0軟件對免疫反應條帶進行定量分析。

表1 本實驗所用一抗Table 1 Primary antibodies employed in this study

1.8 統(tǒng)計學處理

資料用Graph Pad生化數(shù)據(jù)處理軟件包Prism 5.0進行統(tǒng)計處理。計量資料以±s表示，各組均數(shù)間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血糖、血胰島素、外周胰島素抵抗程度以及腦脊液胰島素水平

T2D 組血糖水平及血胰島素水平顯著高于CTL組（P＜0.01），但腦脊液胰島素水平顯著低于CTL組（P＜0.05）。吡格列酮組（PIO 組）血糖及血胰島素水平明顯低于T2D 組（均P＜0.01），與對照組相比無明顯差別，而腦脊液胰島素水平與T2D組相比并無明顯改變，仍低于對照組。運用HOMA－IR公式評估的胰島素抵抗程度結(jié)果顯示，T2D 組外周組織胰島素抵抗程度顯著高于CTL組（P＜0.01），PIO 組外周胰島素抵抗程度顯著低于T2D 組（P＜0.01），但與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（表2）。

表2 研究大鼠實驗室資料（±s，n＝5）Table 2 The result of laboratory examination of rats（±s，n＝5）

表2 研究大鼠實驗室資料（±s，n＝5）Table 2 The result of laboratory examination of rats（±s，n＝5）

與對照組比較，＊P＜0.05＊＊P＜0.01；與2型糖尿病組比較，＃＃P＜0.01

組別處死前體重（kg）血糖濃度（mmol／L）血胰島素濃度（mU／L）腦脊液胰島素濃度（mU／L）胰島素抵抗指數(shù)2型糖尿病組（T2D）436.80±11.82＊＊21.50±7.13＊＊27.54±2.32＊＊1.18±0.78＊28.80±7.01＊＊對照組（CTL）314.40±4.45 6.54±1.35 9.78±1.37 2.82±0.24 2.76±0.34吡格列酮組（PIO）444.60±6.87＊＊8.84±0.73＃＃12.36±2.48＃＃1.14±0.42 4.07±2.11＃＃

2.2 周圍組織胰島素信號傳導途徑PI3K／Akt／GSK－3β活性

我們檢測了周圍組織中位于胰島素信號傳導途徑中重要組成部分的PI3K／Akt／GSK－3β 活性，PI3K 活性通過其下游Akt活性來評估，Akt活性越高，表示PI3K 活性越高。而Akt活性通過磷酸化Akt與總Akt比值來反映，磷酸化Akt／總Akt比例越高，表示Akt以及PI3K 活性越高；GSK－3β的活性由其Ser9磷酸化水平與總GSK－3β的比值來評估，其比值越高，則GSK－3β活性越低。如圖1所示，T2D 組與CTL組比較，肝細胞內(nèi)總Akt以及總GSK－3β 水平無顯著差異，但T2D 組Akt 在Thr308位點上的磷酸化水平及GSK－3β上Ser9的磷酸化水平均顯著低于CTL組（均P＜0.01），此結(jié)果表明T2D大鼠肝臟胰島素信號傳導途徑中Akt活性下降，而下游的GSK－3β活性上升。PIO 組與T2D組比較，總Akt與總GSK－3β水平無顯著差異，但Akt在Thr308位點上的磷酸化水平顯著高于T2D組（P＜0.01），GSK－3β上Ser9的磷酸化水平也顯著高于T2D組（P＜0.05）。表明與正常大鼠比較，T2D組大鼠肝臟胰島素信號傳導減弱，而經(jīng)吡格列酮干預后T2D大鼠肝臟胰島素信號傳導增強。

圖1 免疫印跡法檢測大鼠肝臟內(nèi)胰島素信號途徑關(guān)鍵激酶活性Fig.1 Western blot analysis of related kinases in insulin signal transduction pathway in rat liver tissues

2.3 海馬內(nèi)胰島素信號傳導途徑關(guān)鍵激酶活性以及tau蛋白磷酸化水平

如圖2所示，T2D 組與CTL 組比較，海馬內(nèi)總Akt、總GSK－3β以及總tau蛋白水平無顯著差異，但T2D 組Akt在Thr308位點上的磷酸化水平以及GSK－3β上Ser9的磷酸化水平均顯著低于CTL組（均P＜0.01），同時T2D 組tau蛋白在Ser199、Ser396位點上的磷酸化水平均顯著高于CTL 組（均P＜0.01）。此結(jié)果表明2型糖尿病大鼠大腦胰島素信號傳導途徑中Akt 活性下降，而下游的GSK－3β活性上升，tau蛋白磷酸化程度增加。PIO組與T2D 組比較，總Akt與總GSK－3β水平無顯著差異，但Akt在Thr308 位點上的磷酸化水平及GSK－3β上Ser9的磷酸化水平均顯著高于T2D 組（均P＜0.01），tau蛋白在Ser396和Ser199位點上的磷酸化水平均顯著低于T2D 組（P＜0.05或P＜0.01）。表明與正常大鼠比較，T2D 組大鼠大腦胰島素信號傳導減弱，而應用吡格列酮干預后大腦胰島素信號傳導增強，從而使tau蛋白磷酸化程度降低，AD 樣病變得以減輕。

圖2 免疫印跡法檢測大鼠海馬內(nèi)胰島素信號途徑關(guān)鍵激酶活性及tau蛋白磷酸化水平Fig.2 Western blot analysis of related kinases in insulin signal transduction pathway and the level of phosphyorlated tau protein inrat hippocampus

3 討論

研究證實：①T2D 大鼠大腦組織也呈AD 樣病變；②海馬細胞內(nèi)糖原合成酶激酶－3β（GSK－3β）活性上升。GSK－3β是導致tau蛋白出現(xiàn)磷酸化的關(guān)鍵酶，過度磷酸化的tau蛋白易形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，促進AD 的發(fā)生［15－16］。GSK－3β在胰島素信號傳導途徑中位于磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3kinase，PI3K）／蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）下游，其活性受PI3K／Akt抑制［17］，由此推測T2D腦內(nèi)胰島素信號轉(zhuǎn)導障礙，PI3K／Akt活性下降，即腦內(nèi)胰島素抵抗，導致GSK－3β 活性上升，使tau蛋白過度磷酸化。我們的研究中，在檢測T2D大鼠大腦神經(jīng)細胞內(nèi)的胰島素信號傳導中各激酶的活性時發(fā)現(xiàn)，PI3K／Akt活性下降，而位于其下游的GSK－3β活性上升，外周組織肝臟中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，與上述研究結(jié)果一致。經(jīng)吡格列酮干預后，T2D大鼠外周胰島素抵抗程度顯著降低，腦內(nèi)tau蛋白磷酸化程度降低，但腦脊液胰島素水平無明顯改變，此結(jié)果說明T2D 大鼠大腦中不僅胰島素水平下降，也存在胰島素信號傳導途徑的異常，考慮為胰島素抵抗，并由此導致tau蛋白過度磷酸化，加重腦AD樣病變的發(fā)生。

前文已經(jīng)提到，大腦胰島素缺乏在AD 形成中起重要作用，但T2D 大鼠大腦胰島素水平如何變化尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，外周血液胰島素水平持續(xù)增高可使運送到大腦的胰島素減少，產(chǎn)生大腦的胰島素抵抗狀態(tài)，從而導致腦脊液中胰島素水平下降［18］。本實驗結(jié)果顯示，T2D 大鼠外周血胰島素水平增高，大腦胰島素水平與對照組相比顯著下降，說明T2D 大鼠外周血胰島素通過血腦屏障少于對照組，與上述研究結(jié)果一致。噻唑烷二酮類（TZD）作為改善胰島素抵抗的藥物已在臨床上得到廣泛使用。已有研究發(fā)現(xiàn)TZD 類藥物吡格列酮能改善糖尿病合并AD 患者認知功能［12］。我們用吡格列酮對T2D 大鼠進行干預后吡格列酮組大鼠大腦胰島素水平與T2D 組比較并無明顯改變，但大腦胰島素信號途徑上調(diào)，tau蛋白磷酸化降低。表明吡格列酮是通過改善腦內(nèi)胰島素抵抗而不是提高腦內(nèi)胰島素濃度減輕tau蛋白過度磷酸化的。

綜上所述，我們的結(jié)果說明T2D 大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織一樣存在胰島素抵抗并由此導致tau蛋白過度磷酸化，加重腦AD 病樣改變，同時外周胰島素通過血腦屏障減少。應用胰島素增敏劑降低了腦內(nèi)胰島素抵抗并減輕腦tau 蛋白過度磷酸化，而腦胰島素濃度并未升高，因此T2D 大鼠大腦內(nèi)存在的胰島素抵抗可能是導致AD 發(fā)病的重要原因，而腦脊液胰島素濃度的變化在T2D 大鼠AD 樣病變中的作用可能并不重要。

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