5－羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因長(zhǎng)度多態(tài)性與孤獨(dú)癥譜系障礙易感性關(guān)系的Meta分析＊

莫?jiǎng)倌校?戚小兵， 邵珊珊， 孫 昭， 宋然然△

1武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060

2廣東省珠海市婦幼保健院，珠海 519001

3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)系，武漢 430030

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是以社會(huì)交往障礙、語(yǔ)言發(fā)育障礙、興趣范圍狹窄、重復(fù)刻板行為為主要臨床表現(xiàn)的綜合征，是常見(jiàn)的兒童廣泛性發(fā)育障礙之一。它起病于嬰幼兒期，最新的一項(xiàng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)顯示全球ASD 發(fā)病率的平均水平為6.2‰［1］。孤獨(dú)癥患兒的感知思維、言語(yǔ)、注意、智力等認(rèn)知功能都可能受到損害，并持續(xù)一生，給整個(gè)家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)［2］。

ASD 的病因和發(fā)生機(jī)制仍不十分清楚。大量研究顯示遺傳因素在ASD 的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［3－5］。而在目前研究的數(shù)百種與ASD 相關(guān)的基因中，針對(duì)5－羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（5－HTT，也稱(chēng)SLC6A4）長(zhǎng)度多態(tài)性（5－HTTLPR）的研究最多，其原因在于：①5－羥色胺參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，與社交行為、攻擊行為及焦慮等情緒相關(guān)［6］；②多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)部分孤獨(dú)癥患兒全血中5－羥色胺濃度較高［7－9］；③5－羥色胺重?cái)z取抑制劑（對(duì)5－羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體有特異性的靶向作用）能夠改善孤獨(dú)癥患兒的行為障礙，如減少重復(fù)刻板的動(dòng)作、減少攻擊性行為［10－11］。Cook等［12］在1997年首次報(bào)道了5－HTTLPR 的S等位基因與ASD 發(fā)病相關(guān)，然而隨后的20 多項(xiàng)研究的結(jié)果并不一致。因此，本研究采用Meta分析的方法整合已發(fā)表的研究數(shù)據(jù)，以期通過(guò)擴(kuò)大樣本量對(duì)5－HTTLPR 與ASD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間關(guān)系進(jìn)行更加穩(wěn)定和可靠的評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索策略

本研究首先在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“serotonin AND transporter AND autism”，“autistic disorder／genetics AND SLC6A4protein，human”，“autism AND SLC6A4”和“autism AND 5－HTTLPR”檢索式進(jìn)行檢索；其次，在Embase及ISI Web of Science等英文數(shù)據(jù)庫(kù)中以檢索式“autism AND SLC6A4”和“autism AND 5－HTTLPR”再次進(jìn)行檢索；最后，以“孤獨(dú)癥、SLC6A4、5－HTTLPR、多態(tài)性”為檢索詞檢索CNKI、維普、萬(wàn)方等中文文獻(xiàn)庫(kù)。檢索時(shí)，無(wú)語(yǔ)種限制，并采用了參考文獻(xiàn)回溯法以求全面檢索截止于2012年10月公開(kāi)發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)。如果研究數(shù)據(jù)有重疊，本研究只納入最早或最完整的數(shù)據(jù)；如果文獻(xiàn)中對(duì)孤獨(dú)癥的診斷同時(shí)采用了嚴(yán)格和寬泛的標(biāo)準(zhǔn)，本研究?jī)H摘錄基于嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)診斷所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。

1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)

①研究對(duì)象為孤獨(dú)癥患者，且文中提供了詳細(xì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②研究為分析5－HTTLPR 與孤獨(dú)癥易感性關(guān)系的病例對(duì)照研究或家系研究，且家系研究采用傳遞／不平衡檢驗(yàn)（transmission／disequilibrium test，TDT）；③文獻(xiàn)中提供相關(guān)等位基因的頻數(shù)分布或有可以計(jì)算出相關(guān)頻數(shù)分布的信息。摘要、綜述、個(gè)案報(bào)道、動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)不納入本研究。

1.3 數(shù)據(jù)提取

所有數(shù)據(jù)由2名作者分別獨(dú)立提取，以確保數(shù)據(jù)提取無(wú)誤。提取的信息包括：第一作者、發(fā)表年份、診斷標(biāo)準(zhǔn)、研究對(duì)象所屬的國(guó)家、研究設(shè)計(jì)類(lèi)型、樣本量及等位基因頻數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

參照Kazeem 等［13］提供的方法合并TDT 和病例對(duì)照研究的數(shù)據(jù)。采用Cochran’s Q 檢驗(yàn)對(duì)納入研究進(jìn)行異質(zhì)性評(píng)價(jià)，若Q 統(tǒng)計(jì)量的Pheterogeneity＜0.1則認(rèn)為各研究間存在異質(zhì)性，從而采用隨機(jī)效應(yīng)模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，反之，采用固定效應(yīng)模型。分層分析依次以研究設(shè)計(jì)類(lèi)型、樣本量大小和研究人群來(lái)源作為分層因素。采用漏斗圖和Egger’s回歸檢驗(yàn)來(lái)識(shí)別發(fā)表偏倚，并通過(guò)敏感性分析評(píng)價(jià)Meta分析結(jié)果的穩(wěn)定性。以上所有統(tǒng)計(jì)分析均采用R 軟件的Catmap V 1.6 軟件包完成（http：／／www.r－project.org）。除 Q 檢驗(yàn)的Pheterogeneity外，其余P 值的顯著性水平均為0.05。

2 結(jié)果

2.1 Meta分析所引用文獻(xiàn)的基本情況

根據(jù)上文所述的檢索方法和納入標(biāo)準(zhǔn)，本次Meta分析初步納入英文文獻(xiàn)23 篇和中文文獻(xiàn)3篇。其中Coutinho等［14］2007 年發(fā)表的文章疑似與其在2004年發(fā)表的文章數(shù)據(jù)重合，因此未納入本研究。另外，Guhathakurta等［15］在2006 年發(fā)表的文章中，其病例對(duì)照研究和家系研究存在樣本重疊的情況，為與2008 年Huang等［16］發(fā)表的一篇Meta分析文章進(jìn)行比較，本研究選取其家系研究的數(shù)據(jù)。因此，本次Meta分析最終納入22 篇英文文獻(xiàn)和3 篇中文文獻(xiàn)，其中包括家系研究19項(xiàng)，累積家庭1 788個(gè)；病例對(duì)照研究6項(xiàng)，累積病例510例，對(duì)照835 例。納入文獻(xiàn)的基本情況見(jiàn)表1。

2.2 Meta分析結(jié)果

異質(zhì)性檢驗(yàn)顯示納入Meta分析的25 項(xiàng)研究之間存在異質(zhì)性（Pheterogeneity＝0.000），因此采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并數(shù)據(jù)。合并后OR 值為1.10（95%CI＝0.95～1.26），顯示5－HTTLPR 與ASD 易感性之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。圖1 為合并病例對(duì)照和TDT 研究的Meta分析森林圖。

表1 Meta分析中引用文獻(xiàn)的基本特征Table 1 Characteristics of studies included in the meta－analysis

圖1 合并病例對(duì)照研究和TDT 研究的Meta分析森林圖Fig.1 The forest plots of the combined result of case－control and TDT studies on the association between 5－HTTLPR and ASD

2.3 分層分析

首先，按研究設(shè)計(jì)類(lèi)型進(jìn)行分層。分別對(duì)6項(xiàng)病例對(duì)照研究和19 項(xiàng)TDT 研究進(jìn)行Meta分析，異質(zhì)性檢驗(yàn)的Pheterogeneity分別為0.001和0.000，故均采用隨機(jī)效應(yīng)模型。病例對(duì)照研究的合并OR 值為1.19（95%CI＝0.83～1.72），TDT 研究的合并OR 值為1.07（95%CI＝0.92～1.25），表明無(wú)論是對(duì)病例對(duì)照研究還是對(duì)TDT 研究的Meta分析均顯示，5－HTTLPR與ASD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。

其次，按樣本量大小進(jìn)行分層。本次研究把家庭數(shù)大于150的TDT 研究和病例數(shù)大于150的病例對(duì)照研究歸為大樣本研究，小于等于150的歸為小樣本研究。異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，大樣本研究之間不存在異質(zhì)性（Pheterogeneity＝0.317），采用固定效應(yīng)模型合并數(shù)據(jù)，合并OR 值為1.14（95%CI＝0.98～1.34）；而小樣本研究之間依然存在異質(zhì)性（Pheterogeneity＝0.000），隨機(jī)效應(yīng)模型合并OR 值為1.09（95%CI＝0.92～1.29），表明無(wú)論是對(duì)大樣本研究還是對(duì)小樣本研究的Meta分析均顯示，5－HTTLPR 與ASD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。

最后，按研究人群來(lái)源進(jìn)行分層分析。根據(jù)每個(gè)研究的研究對(duì)象所來(lái)自的地域不同，我們將納入的研究劃分為美洲人群、歐洲人群和亞洲人群3層。結(jié)果顯示，8項(xiàng)針對(duì)美洲人群研究的合并OR 值為1.25（95%CI＝1.12～1.40，Pheterogeneity＝0.154），顯示5－HTTLPR與ASD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，且等位基因S為危險(xiǎn)型；9項(xiàng)針對(duì)歐洲人群的研究的合并OR 值為1.03（95%CI＝0.84～1.28，Pheterogeneity＝0.043），未發(fā)現(xiàn)5－HTTLPR 與ASD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；4 項(xiàng)針對(duì)亞洲人群的研究的合并OR 值為0.81（95%CI＝0.66～0.99，Pheterogeneity＝0.267），支持5－HTTLPR與ASD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，但等位基因L 為危險(xiǎn)型。另外2項(xiàng)研究由于研究人群分別是非洲人群［17］和混合人群［18］，所以未納入本次分層分析。分層分析結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 敏感性分析

為考察各研究對(duì)于總體合并OR 值的影響，我們采用了文獻(xiàn)逐一剔除的敏感性分析方法。敏感性分析的結(jié)果顯示，剔除任何一項(xiàng)獨(dú)立研究之后本研究結(jié)果均未發(fā)生本質(zhì)變化，表明本次Meta分析的結(jié)果較為穩(wěn)定（表3）。

表2 分層分析Table 2 Stratified analysis

表3 敏感性分析Table 3 Sensitivity analysis

2.5 發(fā)表偏倚的估計(jì)

漏斗圖顯示（圖2），散點(diǎn)分布基本對(duì)稱(chēng)，且Egger’s回歸檢驗(yàn)表明本次Meta分析不存在明顯發(fā)表偏倚（P＝0.366）。

圖2 合并病例對(duì)照研究和TDT 研究的Meta分析漏斗圖Fig.2 The funnel plots of the combined result of case－control and TDT studies on the association between 5－HTTLPR and ASD

3 討論

本研究采用Meta分析的方法整合1 788個(gè)孤獨(dú)癥家系、510例病例和835例對(duì)照的研究數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，5－HTTLPR與ASD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間無(wú)顯著相關(guān)。敏感性分析顯示該結(jié)果具有較好的穩(wěn)定性，且經(jīng)漏斗圖和Egger’s回歸檢驗(yàn)，本次Meta分析不存在明顯的發(fā)表偏倚。此外，由于TDT 研究可以有效避免在病例對(duì)照研究中由于人群分層問(wèn)題而導(dǎo)致的虛假關(guān)聯(lián)，因而將兩種設(shè)計(jì)類(lèi)型的研究進(jìn)行合并分析，無(wú)疑可以在較大程度上保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5－羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（5－HTT）是位于17號(hào)染色體端粒區(qū)的長(zhǎng)度為37.8kb的一段序列［19］，該基因啟動(dòng)子區(qū)域的一段22bp的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number of tandem repeat，VNTR）的存在，使得它有2 個(gè)等位基因S（14 次重復(fù)）和L（16次重復(fù)）［20］，表現(xiàn)為5－羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體長(zhǎng)度多態(tài)性（5－HTTLPR）。5－羥色胺是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要神經(jīng)遞質(zhì)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在部分患者體內(nèi)存在5－羥色胺的高表達(dá)，且5－羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑能有效改善孤獨(dú)癥患兒的重復(fù)刻板行為和攻擊行為?；谝陨显颍恢币詠?lái)5－HTTLPR 作為影響ASD 風(fēng)險(xiǎn)發(fā)病的重要多態(tài)位點(diǎn)之一而被廣泛研究。然而，有關(guān)5－HTTLPR與ASD 之間關(guān)系的多項(xiàng)研究結(jié)果并不一致。在Cook等［12］首次報(bào)道5－HTTLPR 的S等位基因會(huì)顯著增加ASD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之后，有5項(xiàng)研究支持他的結(jié)論［17，21－24］，但有2項(xiàng)研究的結(jié)論與之相反［25－26］，認(rèn)為L(zhǎng) 等位基因才是增加ASD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn) 的 危 險(xiǎn) 等 位 基 因，另 外 17 項(xiàng) 研究［15，17－18，21－24，27－41］并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)5－HTTLPR 與ASD之間存在顯著關(guān)聯(lián)。為了明確二者之間的關(guān)系，本次Meta分析整合了這25個(gè)研究，其結(jié)果是尚無(wú)足夠的證據(jù)表明5－HTTLPR 與ASD 之間存在顯著關(guān)聯(lián)。

為了探索異質(zhì)性的來(lái)源，我們進(jìn)行了分層分析。以研究設(shè)計(jì)類(lèi)型作為分層因素進(jìn)行分析后，各層異質(zhì)性并未消失，顯示該因素不是異質(zhì)性的來(lái)源。然而，以樣本量大小和研究人群來(lái)源作為分層因素進(jìn)行分析后，在大樣本、美洲人群及亞洲人群的各研究間并未發(fā)現(xiàn)顯著異質(zhì)性，提示這兩個(gè)因素可以解釋部分異質(zhì)性。值得關(guān)注的是，5－HTTLPR 與ASD之間的關(guān)系在不同地域人群中存在較大差異，體現(xiàn)為：在美洲人群中，S等位基因與ASD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的增加顯著相關(guān)；在亞洲人群中，L 等位基因與ASD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的增加顯著相關(guān)；而在歐洲人群中，未發(fā)現(xiàn)兩者之間的關(guān)聯(lián)。這一現(xiàn)象可能是由于不同人群中5－HTT 的突變率不同所致。然而，由于納入本次Meta分析的大部分研究?jī)H提供了研究人群選取的地域信息，缺乏相關(guān)的人種信息，因而在本研究中只能以研究人群來(lái)源地域作為分層因素，從而可能存在同一地域種族混雜的情況，在一定程度上影響了結(jié)果的解釋。

綜上所述，本研究尚未發(fā)現(xiàn)5－HTTLPR 與ASD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間存在明顯關(guān)聯(lián)。然而，基于ASD是一種由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用而導(dǎo)致的復(fù)雜性疾病，本研究只考慮了遺傳因素對(duì)ASD 的影響，且只提取了5－HTT 基因上一個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息，從而限制了基因－基因，基因－環(huán)境交互作用的探討，具有一定局限性。此外，5－HTTLPR 與ASD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系在不同地域人群中可能存在較大差異，今后仍需進(jìn)一步探討。

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