AAV2介導(dǎo)ND4基因治療LHON 不同免疫抑制方案的比較研究＊

高 晶， 石 慧， 裴 晗， 萬(wàn) 幸， 胡維琨， 李 濤， 杜 皓， 李 斌

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院眼科，武漢 430030

Leber 遺傳性視神經(jīng)病變（Leber hereditary optic neuropathy，LHON）是一種嚴(yán)重危害人類視力的遺傳性疾病，常累及黃斑乳頭束纖維，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞死亡。臨床主要癥狀為雙眼同時(shí)或先后發(fā)生的急性或亞急性無(wú)痛性視力減退，主要是由線粒體DNA 突變引起，其中G11778A 核苷酸位點(diǎn)是最常見(jiàn)的發(fā)病位點(diǎn)［1］，60%病例為該位點(diǎn)突變，此突變使呼吸鏈上NADH 脫氫酶亞單位4（NADH dehydrogenase subunit 4，ND4）基因編碼的氨基酸發(fā)生改變，當(dāng)前尚無(wú)有效的治療方法。

2007年英國(guó)和美國(guó)的兩個(gè)研究小組分別利用腺相關(guān)病毒血清型2（adenovirus associated virus 2，AAV2）載體攜帶RPF65基因轉(zhuǎn)染到人的眼內(nèi)治療LHON，結(jié)果顯示基因替代治療改善了患者的視力［2－3］，使我們看到了基因治療遺傳性疾病的希望。ND4基因突變?cè)贚HON 患者中占半數(shù)以上，因此轉(zhuǎn)染ND4基因被認(rèn)為是治療LHON 更有效的方案。目前AAV2病毒重組基因治療遺傳性眼內(nèi)疾病有兩種方法：玻璃體腔注射和視網(wǎng)膜下注射。現(xiàn)有的研究證實(shí)，視網(wǎng)膜下注射起效時(shí)間較慢（2～4周內(nèi)），且轉(zhuǎn)染的細(xì)胞主要是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和部分感光細(xì)胞，而玻璃體腔注射1周后視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90%以上，可有效挽救LHON 患者急性期急劇下降的視力［4］。但視網(wǎng)膜下注射存在一定程度的免疫赦免效應(yīng)，但玻璃體腔注射能誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)［5－8］，出現(xiàn)相應(yīng)的中和抗體，將影響AAV2介導(dǎo)的ND4基因轉(zhuǎn)染表達(dá)效率。因此如何減輕AAV2所引起的免疫反應(yīng)是AAV2在臨床應(yīng)用的關(guān)鍵所在。

基于上述觀點(diǎn)，本研究設(shè)計(jì)了不同的免疫抑制方案：以強(qiáng)的松為代表的糖皮質(zhì)激素在臨床應(yīng)用最為廣泛，它能抑制吞噬細(xì)胞處理抗原及抑制B 細(xì)胞分化、減少抗體產(chǎn)生，常常是用來(lái)抑制免疫反應(yīng)的首選藥物。曲安奈德是一種長(zhǎng)效的糖皮質(zhì)激素，臨床上玻璃體腔注射曲安奈德已被公認(rèn)是一種成熟有效的免疫抑制治療方案。環(huán)孢霉素A 是一種新型強(qiáng)效的免疫抑制劑，它能選擇性抑制輔助性T 細(xì)胞B細(xì)胞，促進(jìn)抑制性T 細(xì)胞，從而抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)。這些藥物被公認(rèn)在治療眼科免疫性疾病有成熟的治療方案和明確的臨床效果。我們選擇上述藥物用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察ND4的表達(dá)效率及全身免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱，為將來(lái)的臨床治療選擇一種最優(yōu)的方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

健康雄性SD 大鼠20只（同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供），體重150～180g；AAV2－ND4（本實(shí)驗(yàn)室提供［9－10］）；環(huán)孢霉素A（瑞士諾華公司）；強(qiáng)的松片（天津力生制藥股份有限公司）；曲安奈德（昆明積大制藥有限公司）；0.01mol／L 磷酸緩沖鹽溶液（美國(guó)Sigma公司）；水合氯醛、多聚甲醛、蔗糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸奧布卡因滴眼液（參天制藥株式會(huì)社）；ELISA 試劑盒（美國(guó)R＆D 公司）；抗ND4單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；綠色熒光蛋白多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；OCT 包埋劑（美國(guó)Sakura Finetek公司）。

1.2 玻璃體腔注射重組體腺相關(guān)病毒

SD 大鼠腹腔注射10%水合氯醛至安靜后，右眼局部予鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉。在距角膜緣外3mm 處穿刺睫狀體平坦部進(jìn)入玻璃體腔內(nèi)。實(shí)驗(yàn)分為5組，每組4 只大鼠，A 組為未免疫抑制組，B組為環(huán)孢霉素A 組，C 組為強(qiáng)的松組，D 組為強(qiáng)的松＋曲安奈德組，E 組為對(duì)照組。A、B、C 組每只大鼠注射4μL AAV2－ND4［病毒含量為8.8×108vg（vg＝vector genome）］，D 組每只大鼠注射4 μL AAV2－ND4＋曲安奈德（1∶1等體積混合，其中病毒含量為8.8×108vg，曲安奈德160μg），對(duì)照組E組注射4μL 0.01mol／L 磷酸緩沖鹽溶液，術(shù)后紅霉素眼膏敷眼。

1.3 術(shù)后全身用藥

B、C、D 組從玻璃體腔注射術(shù)后第1 天開(kāi)始全身給藥，采用灌胃的方式給予藥物，連續(xù)4周。B組給予環(huán)孢霉素A，起始劑量10mg／（kg·d），2周后減量為5mg／（kg·d）。C、D 組給予強(qiáng)的松片，起始劑量5 mg／（kg·d），2 周后減量為2.5 mg／（kg·d）。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）

用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中對(duì)大鼠AAV2衣殼蛋白和ND4基因的抗體含量。ELISA 試劑盒采用雙夾心酶聯(lián)免疫吸附法。在預(yù)先包被AAV2 或ND4基因單克隆抗體酶標(biāo)孔加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋后的樣品血清，加入HRP 標(biāo)記過(guò)的相應(yīng)酶標(biāo)試劑，37℃溫育30min，之后加入TMP和H2O2顯色底物，H3PO4終止顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度（A）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的A 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A 值和直線回歸方程計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。測(cè)出的每孔濃度乘以血清的稀釋倍數(shù)即得到待測(cè)樣品濃度。分別于玻璃體腔注射術(shù)后3d、7d、4周、8周、12周取各組大鼠尾靜脈血液標(biāo)本，進(jìn)行ELISA 檢測(cè)。

1.5 視網(wǎng)膜切片及免疫熒光檢測(cè)

在玻璃體腔注射AAV2－ND4 12周后，過(guò)量麻醉處死大鼠，立即摘除雙側(cè)眼球浸泡于4%多聚甲醛中。1h后移除角膜和晶體組織，制成眼球后段眼杯。浸泡于30%蔗糖過(guò)夜，取出予以O(shè)CT 包埋劑包被。冰凍切片機(jī)切片，視網(wǎng)膜切片厚度10μm。0.01mol／L PBS漂洗切片，一抗（抗ND4）4℃孵育過(guò)夜，二抗（綠色熒光蛋白）37℃孵育1h，激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司，Leica TCS－SP5）觀察熒光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的數(shù)據(jù)資料均以±s表示，對(duì)玻璃體腔注射后不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)ELISA 所檢測(cè)的各組數(shù)據(jù)選用單因素多水平設(shè)計(jì)定量資料方差分析。組間樣本均數(shù)與對(duì)照組的比較采用Dunnett－t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜切片免疫熒光檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組（A～D 組）與對(duì)照組（E 組）比較，視網(wǎng)膜切片視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層（retinal ganglion cells layer，RGCs）明顯有ND4陽(yáng)性表達(dá)，而在視網(wǎng)膜其它各層無(wú)明顯特異性表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1 視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層免疫熒光染色示ND4蛋白表達(dá)（共聚焦顯微鏡，×200）Fig.1 Immunofluorescence staining of ND4in retinal ganglion cell layer（laser confocal microscope，×200）

2.2 ELISA檢測(cè)各組大鼠血清中抗ND4基因抗體濃度

各組血清抗ND4基因抗體濃度－時(shí)間折線圖見(jiàn)圖2。比較在玻璃體腔注射后第3、7天及28天時(shí)，各組抗體濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。而在第56天時(shí)A～D 各組抗體濃度均顯著增加，其中A、C 組增加幅度較B、D 組大。第84天時(shí)A～C 組抗體濃度出現(xiàn)不同程度下降，D 組則小幅度增加，而在此時(shí)間點(diǎn)下，B～D 組抗體濃度與A 組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均明顯高于對(duì)照組E（表1）。

2.3 ELISA檢測(cè)各組大鼠血清中抗AAV2抗體濃度

各組血清抗AAV2抗體濃度－時(shí)間折線圖見(jiàn)圖3。玻璃體腔注射后第3天時(shí)，各組抗體濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。而在第7天，A～D 組抗體濃度出現(xiàn)不同程度下降，但在此時(shí)間點(diǎn)下組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)?shù)?8天時(shí)，A～D 組抗體濃度均明顯增加，其中A、C 組抗體濃度高于B、D 組。到第56天時(shí)，除B 組外各組抗體濃度均出現(xiàn)下降，特別是A、D 組抗體濃度與對(duì)照組E間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而B(niǎo)、C組抗體濃度仍高于對(duì)照組E（表2）。

圖2 血清抗ND4基因抗體濃度時(shí)間折線圖Fig.2 The concentration－time relationship of the serum antibody against ND4after intravitreal injection

圖3 血清抗AAV2抗體濃度時(shí)間折線圖Fig.3 The concentration－time relationship of the serum antibody against AAV2after intravitreal injection

表1 各組血清抗ND4基因抗體濃度的比較（±s，n＝4，ng／L）Table 1 Comparison of the concentration of serum antibody against ND4among groups（±s，n＝4，ng／L）

表1 各組血清抗ND4基因抗體濃度的比較（±s，n＝4，ng／L）Table 1 Comparison of the concentration of serum antibody against ND4among groups（±s，n＝4，ng／L）

與A 組比較，＊P＜0.05；與E組比較，rP＜0.05

Group s 3d7d28d56d84d A 90.120±10.573 100.525±2.543 110.170±8.599 180.969±5.576r130.240±27.930 r B 89.952±3.316 103.725±15.464 100.751±8.137 145.095±0.075＊r142.819±0.120r C 90.658±4.280 107.849±6.106 104.797±10.632 185.657±16.230r150.025±18.057r D 79.546±4.017 101.453±11.329 99.341±2.252 151.542±0.233＊r158.497±0.371r E 96.618±12.093 93.114±6.577 110.383±20.554 117.754±4.985 90.406±6.021 F 0.625 0.320 0.195 30.646 3.849 P＞0.05＞0.05＞0.05＜0.01＜0.05

表2 各組血清AAV2抗體濃度的比較（±s，n＝4，pg／L）Table 2 Comparison of the concentration of the serum antibody against AAV2among groups（±s，n＝4，pg／L）

表2 各組血清AAV2抗體濃度的比較（±s，n＝4，pg／L）Table 2 Comparison of the concentration of the serum antibody against AAV2among groups（±s，n＝4，pg／L）

與A 組比較，＊P＜0.05；與E組比較，rP＜0.05

s 3d7d28d56d Group A 65.439±10.158 35.561±5.134 137.504±43.835r 90.624±5.632 B 79.057±16.179 59.412±5.292 98.359±7.107＊105.978±12.712r C 78.017±9.660 58.191±11.248 133.401±20.915r112.400±8.183＊r D 66.795±0.901 36.249±7.976 112.995±7.808＊r79.454±0.865 E 71.577±16.112 68.226±20.580 95.631±7.259 80.978±5.265 F 0.272 1.635 24.789 8.060 P＞0.05＞0.05＜0.01＜0.01

3 討論

目前LHON 在臨床上沒(méi)有有效的治療方法。隨著基因工程技術(shù)的日益發(fā)展，基因治療有可能成為治療LHON 的新希望。玻璃體腔內(nèi)注射AAV2－ND4重組體基因被認(rèn)為是一種有效的導(dǎo)入方式［11－12］，其N(xiāo)D4基因表達(dá)的有效性在國(guó)外研究組和我們的前期研究中已得到證實(shí)［13］。而玻璃體腔內(nèi)注射能引起機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，這對(duì)ND4基因表達(dá)的安全性是一定挑戰(zhàn)。為此，我們研究組設(shè)計(jì)了上述實(shí)驗(yàn)，觀察3個(gè)月內(nèi)其體內(nèi)相應(yīng)抗體濃度變化和ND4基因表達(dá)，以了解相關(guān)免疫反應(yīng)的變化特點(diǎn)和選擇合適的免疫抑制藥物，為將來(lái)基因治療安全應(yīng)用于臨床提供參考。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在注射后84d，各免疫抑制組RGCs 層仍可見(jiàn)到ND4 表達(dá)。這說(shuō)明了AAV2病毒介導(dǎo)ND4基因能轉(zhuǎn)染RGCs并長(zhǎng)效表達(dá)，未明顯受到全身抗體免疫反應(yīng)的影響。各實(shí)驗(yàn)組血清ND4基因抗體濃度在注射后56d時(shí)抗體濃度增加顯著，達(dá)到或接近峰值（圖2），初步說(shuō)明其免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)期主要集中在注射后56d內(nèi)。而各實(shí)驗(yàn)組抗AAV2抗體濃度則在注射后28d時(shí)明顯升高，除B組外56d時(shí)濃度輕度下降。這與有些研究者認(rèn)為的2個(gè)月時(shí)抗體濃度才達(dá)到最大值的研究有所不同。我們分析，這一結(jié)果可能與注射方式有關(guān)，Li等［14］采用的是多次玻璃體腔注射，而我們采用的是單次玻璃體腔注射AAV2－ND4，且注射的病毒量少于對(duì)方，可能初次預(yù)敏不足以刺激產(chǎn)生大量的抗體，機(jī)體難以長(zhǎng)期持續(xù)高抗體水平。這一結(jié)果也提示，減小玻璃體腔注射劑量能夠減輕免疫反應(yīng)。

另外，通過(guò)比較各組間實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為，無(wú)論是糖皮質(zhì)激素還是環(huán)孢素A，都未能達(dá)到抑制AAV2－ND4相應(yīng)免疫反應(yīng)的理想效果?？诜?qiáng)的松組（C組）免疫抑制效果相對(duì)最弱，與未免疫抑制組（A 組）比較差異不明顯。而環(huán)孢素A（B組）和曲安奈德玻璃體腔注射＋術(shù)后口服強(qiáng)的松片（D 組）雖可在免疫反應(yīng)高峰期間發(fā)揮一定的免疫抑制作用，但觀察其高峰期后效果卻有限。然而上述方法存在較多并發(fā)癥，如環(huán)孢霉素A 全身毒副作用較大，損害腎功能，加重機(jī)體負(fù)擔(dān)；而曲安奈德的注射會(huì)引起高眼壓癥狀，加速白內(nèi)障發(fā)展。這些問(wèn)題都會(huì)阻礙它們?cè)谂R床基因治療中的應(yīng)用。權(quán)衡利弊，這幾種方法都并非最佳選擇。

因此在未來(lái)的臨床治療中，可以考慮通過(guò)3個(gè)途徑解決這一問(wèn)題，治療前對(duì)患者進(jìn)行檢測(cè)，選擇AAV2抗體陰性患者進(jìn)行基因治療，而AAV2抗體與CD8密切相關(guān)［15－16］，同時(shí)檢測(cè)患者CD8的值，正常者方可接受基因治療；在治療中，我們此前研究及本實(shí)驗(yàn)確定AAV2－ND4的注射劑量為2×1011vg／mL，如果能進(jìn)一步減小劑量，可降低免疫反應(yīng)的程度；在治療后，檢測(cè)患者免疫反應(yīng)半年甚至更長(zhǎng)時(shí)間，特別是前3個(gè)月，需密切監(jiān)測(cè)體內(nèi)抗體水平。

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