中間球海膽體腔細(xì)胞損失后的恢復(fù)規(guī)律及恢復(fù)期中軸器觀察*

紀(jì)錦霖 孟少東 王軼南 丁 君 李 強(qiáng)

中間球海膽體腔細(xì)胞損失后的恢復(fù)規(guī)律及恢復(fù)期中軸器觀察*

紀(jì)錦霖1,2孟少東1,2王軼南1,2①丁 君1李 強(qiáng)2

(1. 大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧 大連 116023； 2. 鹽城工學(xué)院 水生動物免疫與疾病研究所 江蘇 鹽城 224051)

本研究通過人工抽離中間球海膽()體質(zhì)量10%的體腔液誘導(dǎo)體腔細(xì)胞的修復(fù)更新，分組測定6、12、18和24 h后海膽圍臟腔內(nèi)的體腔細(xì)胞密度，分析體腔細(xì)胞的修復(fù)規(guī)律；同時，取各時間點(diǎn)海膽的中軸器進(jìn)行組織學(xué)觀察，并利用鼠抗人Ki-67(細(xì)胞增殖抗原)單克隆抗體檢測中軸器內(nèi)的細(xì)胞增殖信號。結(jié)果顯示，人工抽離體腔液后6 h，體腔細(xì)胞密度與初始密度相比明顯偏低；12 h后逐步升高，密度略低于初始密度，恢復(fù)度為(92.78±29.40)%；18 h后已明顯高于初始密度，恢復(fù)度為(137.08±32.40)%，顯著高于6 h和12 h的恢復(fù)度(<0.05)，隨后，體腔細(xì)胞密度逐漸降低。海膽損失體腔液后，中軸器表現(xiàn)為內(nèi)部組織消減、空腔化，外壁上皮細(xì)胞層崩解、脫離，凸起結(jié)構(gòu)空泡化等變化，18 h后內(nèi)部疏松組織略有增加，24 h后中央腔內(nèi)出現(xiàn)明顯的新生組織。利用Ki-67單克隆抗體檢測發(fā)現(xiàn)，正常海膽中軸器內(nèi)具有一定的細(xì)胞增殖信號，該信號在損失體腔細(xì)胞18 h后明顯增強(qiáng)。結(jié)果表明，損失體腔細(xì)胞后，中間球海膽可啟動快速恢復(fù)機(jī)制，而海膽的中軸器發(fā)生明顯的組織結(jié)構(gòu)變化，組織內(nèi)的細(xì)胞增殖活動也明顯增強(qiáng)。研究結(jié)果可為海膽體腔細(xì)胞的造血組織與發(fā)生機(jī)制研究提供依據(jù)。

中間球海膽；體腔細(xì)胞；恢復(fù)規(guī)律；中軸器；造血組織

海膽與海參、海星等同屬棘皮動物門(Echinodermata)，是一類營底棲生活的海洋無脊椎動物，也是生物學(xué)研究中的一種模式生物。由于棘皮動物處于無脊椎動物向脊椎動物分支進(jìn)化的特殊階段，在生物進(jìn)化上占據(jù)獨(dú)特地位，海膽的免疫學(xué)研究可為比較免疫學(xué)提供重要資料(Smith, 2010)。有關(guān)紫球海膽()的基因組測序結(jié)果顯示，紫球海膽有近70%的基因與人類相似，同果蠅和線蟲等其他模式生物相比，海膽在進(jìn)化關(guān)系上與人類更接近，使得其在比較免疫學(xué)研究中的地位愈益顯著(Materna, 2006; Rast, 2006)。海膽的石灰質(zhì)外殼中充滿體腔液，其由變形吞噬細(xì)胞、色素細(xì)胞、纖毛游走細(xì)胞、無色球形細(xì)胞等多種體腔細(xì)胞與細(xì)胞外液組成。海膽的體腔細(xì)胞類似于一般無脊椎動物中所述的血細(xì)胞，不僅具有營養(yǎng)輸送、氣體交換等生理功能，還在免疫防御中承擔(dān)重要角色(de Faria, 2008)。海膽只存在非特異性免疫，其免疫應(yīng)答是由體腔中的體腔細(xì)胞和多種體液免疫因子共同介導(dǎo)的。體腔細(xì)胞通過吞噬、細(xì)胞殺傷、趨化修復(fù)等發(fā)揮細(xì)胞免疫功能，還通過合成與分泌凝集素、穿孔素、溶酶體酶等多種免疫因子廣泛參與機(jī)體的體液免疫(Deveci, 2015)。

血細(xì)胞的來源與發(fā)生機(jī)制一直是無脊椎動物免疫基礎(chǔ)研究的焦點(diǎn)問題之一，探明血細(xì)胞的增殖來源與造血過程可為深入研究機(jī)體的免疫系統(tǒng)和免疫機(jī)制提供依據(jù)(Jia, 2016)。目前，對于無脊椎動物造血作用的相關(guān)了解多集中于節(jié)肢動物，對其他門類的研究比較匱乏(Noonin, 2012)。Grigorian等(2013)研究顯示，昆蟲和其他節(jié)肢動物具有明確的造血器官，其中，未成熟的血細(xì)胞前體(前血細(xì)胞)以及分化成熟的血細(xì)胞分別分布于造血器官的不同區(qū)域，而不同節(jié)肢動物造血器官的位置與內(nèi)部結(jié)構(gòu)差異較大。與其他動物的血細(xì)胞一樣，海膽的體腔細(xì)胞也具有修復(fù)與更新機(jī)制，以維持機(jī)體穩(wěn)定。目前，針對海膽體腔細(xì)胞的來源僅有一些推測，有觀點(diǎn)認(rèn)為，海膽體腔細(xì)胞具有分裂增殖能力，而另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為，海膽體腔細(xì)胞來源于腹膜上皮和中軸器等造血組織，其中，中軸器是最主要的來源部位(da Silva, 2013)。中軸器(軸腺)位于海膽口咽部與反口面篩板連線的中軸區(qū)域，外呈細(xì)長狀，內(nèi)具復(fù)雜的可收縮結(jié)構(gòu)與腔隙，腺體特征顯著，被認(rèn)為是海膽圍臟腔、水管系統(tǒng)及血系統(tǒng)的交匯組織(Millott, 1968)。早期研究對海膽中軸器的功能判斷不一，包括排泄、生產(chǎn)色素、循環(huán)以及免疫、產(chǎn)生體腔細(xì)胞等多種功能，然而均未得到證實(shí)(Millott, 1966; Millott, 1968; Welsch, 1987; Ziegler, 2009)。

中間球海膽()，又稱蝦夷馬糞海膽，于1989年自日本引入中國，其味道鮮美，營養(yǎng)價值高，還具有極高的藥用價值，為我國黃渤海區(qū)域重要的經(jīng)濟(jì)物種(Chang, 2008; 張偉杰等, 2010)。作者前期以抗中間球海膽體腔細(xì)胞單克隆抗體為工具，定位顯示，海膽中軸器中含有大量體腔細(xì)胞，確定中軸器至少是中間球海膽體腔細(xì)胞的儲藏器官(Wang, 2018)。為了進(jìn)一步研究中間球海膽體腔細(xì)胞的來源，本研究通過人工抽取體腔液的方法刺激體腔細(xì)胞的補(bǔ)充更新，進(jìn)而觀察分析體腔細(xì)胞的恢復(fù)規(guī)律，觀察中軸器組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞增殖信號的變化，以期為揭示海膽體腔細(xì)胞的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 海膽

中間球海膽[2齡，(50±10) g]購自遼寧省大連旅順龍王塘海膽?zhàn)B殖場，于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室活體培養(yǎng)室養(yǎng)殖，實(shí)驗(yàn)前馴養(yǎng)14 d。養(yǎng)殖槽水體為3 m3，水深約為1.2 m，水溫為20℃，保持充氧，每2 d投喂海帶1次、更換1/3海水，并吸底清除排泄物。

1.2 體腔液安全抽取量的確定

取3枚海膽于解剖盤中靜置瀝水，待重量趨于穩(wěn)定后稱重。使用手術(shù)剪沿圍口膜外緣剪開，使用移液槍吸取全部體腔液，稱重、計(jì)算體腔液與海膽體重的質(zhì)量比。取9枚海膽，分為3組，使用無菌注射器自圍口膜穿刺，分別抽取海膽體質(zhì)量5%、10%和15%的體腔液，之后，正常養(yǎng)殖并密切觀察14 d。抽取體腔液后，海膽仍能維持正常狀態(tài)并繼續(xù)存活的抽取量視為安全抽取量。

1.3 體腔細(xì)胞的恢復(fù)規(guī)律

取28枚海膽，按1.2確定的最大安全抽取量，使用預(yù)裝有CMFSW-EI緩沖液(449 mmol/L NaCl, 33 mmol/L Na2SO4, 9 mmol/L KCl, 2.5 mmol/L NaHCO3, 30 mmol/L EDTA, 50 mmol/L imidazole, pH 7.4) (Brockton, 2008)的注射器自圍口膜穿刺、抽取海膽體腔液，使體腔液與緩沖液體積比為1∶1，并及時混勻。CMFSW-EI緩沖液具有抗凝集、維持細(xì)胞形態(tài)的作用。采用血球計(jì)數(shù)板顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算每個海膽的初始體腔細(xì)胞密度，并進(jìn)行標(biāo)記。將抽取過體腔液的海膽放回水槽正常養(yǎng)殖，6、12、18和24 h后分別取7枚海膽，各抽取0.5 mL體腔液，并計(jì)算體腔細(xì)胞密度。根據(jù)每個海膽的初始體腔細(xì)胞密度與取樣時體腔細(xì)胞密度，計(jì)算各組體腔細(xì)胞密度均值，進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，以下列公式計(jì)算體腔細(xì)胞恢復(fù)度：

恢復(fù)度=取樣時間點(diǎn)體腔細(xì)胞密度/初始體腔細(xì)胞密度×100%

統(tǒng)計(jì)各組恢復(fù)度均值，并通過單因子方差分析(one-way ANOVA)中的Duncan方法進(jìn)行多重比較。各組海膽在測定體腔細(xì)胞密度后，繼續(xù)用作后續(xù)分析的樣品。

1.4 中軸器組織學(xué)觀察

取正常海膽3枚，并從1.3各組中分別選取3枚海膽，自圍口膜外緣向反口面方向剪開石灰質(zhì)外殼，至約1 cm處轉(zhuǎn)為環(huán)向剪開，將海膽分為2部分，取下中軸器。中軸器使用PBS清洗3次后放入波恩氏液固定，24 h后流水沖洗12 h，隨后，70%酒精沖洗。參考趙彥花等(2019)的方法，經(jīng)70%～100%梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋及切片后，采用HE染色試劑盒(Solarbio)染色。使用顯微鏡(Leica DM2500, 德國)觀察拍照。

1.5 中軸器內(nèi)細(xì)胞增殖信號檢測

取正常海膽3枚，并從1.3各組中分別選取3枚海膽，按1.4中描述的方法解剖分離中軸器，經(jīng)冰凍包埋劑OCT (Sakura)包埋后置于?20℃冰箱冷凍。使用Leica CM1900冰凍切片機(jī)制片，經(jīng)冰凍丙酮固定后滴加鼠抗人Ki-67單克隆抗體(Sigma)，37℃孵育45 min。PBS洗滌3次后滴加FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(Sigma)，37℃孵育45 min。PBS洗滌3次，滴加actin染色劑Alexa Fluor?555 phalloidin (Sigma)室溫染色20 min，PBS洗滌3次，甘油封片，使用顯微鏡(Leica DM2500, 德國)觀察、拍照。陰性對照使用PBS替代Ki-67單克隆抗體，其他步驟同上。

2 結(jié)果

2.1 海膽體腔液的安全抽取量

通過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，正常中間球海膽體腔液占海膽總體質(zhì)量的(26.24±1.29)%。抽取5%體質(zhì)量的體腔液后14 d內(nèi)，海膽攝食正常，管足完全伸出、附著于籠壁上，全部存活；抽取10%體質(zhì)量的體腔液后14 d內(nèi)，海膽攝食正常，可伸出管足附著于籠壁上，全部存活；抽取15%體質(zhì)量的體腔液后，海膽基本無攝食，管足伸展?fàn)顟B(tài)逐漸變差并失去吸附、運(yùn)動能力，5 d后全部死亡。因此，海膽體腔液安全抽取量定為體質(zhì)量的10%以內(nèi)，約為總體腔液的36%～40%。

2.2 體腔細(xì)胞的恢復(fù)規(guī)律

正常狀態(tài)下，中間球海膽體腔細(xì)胞密度為(10.13± 3.08)×106cells/mL (=28)，個體差異較大，最大和最小測定密度分別為15.68×106和5.18×106cells/mL。為保證數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的準(zhǔn)確性及可靠性，以每個海膽的初始體腔細(xì)胞密度與取樣時體腔細(xì)胞密度為基礎(chǔ)，分析體腔細(xì)胞的恢復(fù)規(guī)律(圖1、圖2)。人工抽取體腔液6 h后，海膽體腔細(xì)胞密度為(5.70±1.43)×106cells/mL，低于初始密度[(8.30±3.00)×106cells/mL]，但差異不顯著(>0.05)。6 h后恢復(fù)度為(74.94±29.42)%，但其中有28.6%的個體恢復(fù)度略高于100%。

人工抽取體腔液12 h后，體腔細(xì)胞密度為(11.41±2.18)×106cells/mL，略低于初始密度[(12.75±2.64)× 106cells/mL]，但差異不顯著(>0.05)。12 h后體腔細(xì)胞恢復(fù)度為(92.78±29.40)%，其中，42.9%的個體接近甚至超過初始水平，57.1%的個體低于初始水平。

圖1 各組海膽體腔細(xì)胞密度變化

圖2 中間球海膽體腔細(xì)胞恢復(fù)情況

人工抽取體腔液18 h后，體腔細(xì)胞密度為(14.00± 2.15)×106cells/mL，高于初始密度[(11.04±3.59)× 106cells/mL]，但差異不顯著(>0.05)。18 h后，體腔細(xì)胞恢復(fù)度為(137.08±32.40)%，恢復(fù)度高于150%的海膽有42.9%，與初始水平持平的個體為28.6%。

人工抽取體腔液24 h后，體腔細(xì)胞密度為(10.78±2.08)×106cells/mL，高于初始密度[(8.91±2.44)× 106cells/mL]，但差異不顯著(>0.05)。24 h后，體腔細(xì)胞恢復(fù)度為(125.41±29.24)%，其中，恢復(fù)度高于150%的海膽有28.6%，其余個體大多超過初始水平。

恢復(fù)度隨時間的延長逐漸升高，18 h達(dá)到高峰，隨后降低，其中，18 h組體腔細(xì)胞恢復(fù)度顯著高于 6 h和12 h組(<0.05)；24 h組恢復(fù)度顯著高于6 h組(<0.05)，但與12 h和18 h組相比無顯著差異(>0.05)。

2.3 中軸器組織學(xué)觀察

中間球海膽中軸器為細(xì)長的紅色囊狀組織，長為3～6 mm，解剖后常附于亞氏提燈(口器)(圖3A)或肛門附近(圖3B、圖3C)。石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，正常中間球海膽中軸器外層為相對致密的結(jié)締組織，中央為非規(guī)則形狀的空腔即中央腔，中央腔外緣組織較為疏松，充滿復(fù)雜的腔隙(圖4N1)；尖端部位組織致密、無中央腔(圖4N2)；一些部位的外壁上皮細(xì)胞層平整嚴(yán)密(圖4N1、圖4N3)，有些部位的外壁上皮細(xì)胞層向圍臟腔彌散或凸起，形成內(nèi)具稀疏組織的褶皺或泡狀結(jié)構(gòu)(圖4N1、圖4N4)。

圖3 中間球海膽中軸器

損失體腔細(xì)胞6 h后，海膽的中軸器明顯空腔化，其內(nèi)部疏松組織大量消減甚至缺失，部分區(qū)域僅剩外部致密組織與異常擴(kuò)大的中央腔(圖4R1)；外壁上皮細(xì)胞出現(xiàn)崩解現(xiàn)象(圖4R1)，向體腔伸出的結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)空泡化，內(nèi)部細(xì)胞基本消失(圖4R6)。12 h后，中軸器也表現(xiàn)出明顯的空腔化特征，外壁上皮細(xì)胞層出現(xiàn)崩解、脫離，凸起結(jié)構(gòu)空泡化(圖4R2)。18 h后，中軸器仍表現(xiàn)為空腔化，且尖端部位也出現(xiàn)大量空腔，外壁上皮細(xì)胞層凸起空泡化甚至大片脫離，但其內(nèi)部疏松組織略有增加(圖4R3)。24 h后，中軸器外壁上皮細(xì)胞層大面積脫落，器官略呈現(xiàn)皺縮狀態(tài)，但內(nèi)部出現(xiàn)較多新生組織，中央腔空隙明顯減少(圖4R4)，靠近致密層鄰近的腔隙內(nèi)也出現(xiàn)新生組織(圖4R8)。此外，在6 h后中軸器中觀察到由中央腔經(jīng)外部致密區(qū)向外部延伸的通道(圖4R5)，而外壁上皮細(xì)胞層與下層結(jié)締組織形成的陷窩部位有細(xì)胞自中軸器向外遷徙(圖4R7)。

2.4 中軸器內(nèi)細(xì)胞增殖信號觀察

通過間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，各海膽的中軸器與鼠抗人Ki-67單克隆抗體均呈陽性反應(yīng)，但同一時間點(diǎn)不同個體的樣品之間存在一定差異。正常海膽中軸器的Ki-67信號較弱(圖5A1)；抽取體腔液6 h、12 h后大部分樣品的陽性信號與對照無明顯差異；抽取體腔液18 h (圖5B1)和24 h后，樣品中Ki-67信號明顯增強(qiáng)，熒光信號呈點(diǎn)狀、均勻分布，但2組之間無明顯差異。海膽中軸器與PBS反應(yīng)均呈陰性(圖5C1)。

3 討論

正常狀態(tài)下，海膽體腔細(xì)胞的自我更新比較緩慢，為研究海膽體腔細(xì)胞的組織來源及發(fā)生機(jī)制，本研究通過人工抽取體腔液的方法刺激體腔細(xì)胞的補(bǔ)充更新。經(jīng)測定，2齡海膽體腔液質(zhì)量占總體質(zhì)量的(26.24±1.29)%，與同為棘皮動物的刺參[(25.24± 2.91)%～(30.98±1.86)%]相近(王印庚等, 2010)。海膽體腔液的安全抽取量為體質(zhì)量的10%，約為總體腔液的36%～40%，遠(yuǎn)高于刺參體腔液的安全抽取量(體質(zhì)量1.5%以內(nèi))(王印庚等, 2010)，這可能與物種間的組織構(gòu)造差異較大有關(guān)。

圖4 體腔細(xì)胞修復(fù)期海膽中軸器組織結(jié)構(gòu)

本研究發(fā)現(xiàn)，海膽在人工抽取體腔液后6 h，體腔細(xì)胞密度明顯低于初始值，其原因可能是由于體腔液容積的恢復(fù)速度要快于體腔細(xì)胞的恢復(fù)速度，這與刺參吐臟后體腔液容積快速恢復(fù)(吐臟后 2 h)結(jié)果一致(Li, 2018)。在人工抽取體腔液后12 h，海膽體腔細(xì)胞密度已恢復(fù)至原有水平，18 h時達(dá)到高峰，24 h時又恢復(fù)至原有水平。由此可見，海膽在損失體腔細(xì)胞后，機(jī)體會啟動快速的補(bǔ)充機(jī)制，體腔中迅速聚集大量甚至過量的體腔細(xì)胞，隨后又通過某種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制將體腔細(xì)胞密度降低到正常水平。這一結(jié)果與王印庚等(2010)對刺參體腔液穿刺抽取后體腔細(xì)胞恢復(fù)過程研究不同，刺參在抽取少量(體質(zhì)量的1.5%)體腔液后總細(xì)胞濃度恢復(fù)時間為4 d；但與Li等(2018)的研究中刺參吐臟后體腔細(xì)胞的恢復(fù)規(guī)律比較一致，體腔細(xì)胞數(shù)量在吐臟后6 h時與吐臟前已無顯著差異。本研究中，海膽體腔液的抽取量較大，約占體腔液總量的40%，有效刺激了體腔細(xì)胞的快速修復(fù)。

圖5 中軸器內(nèi)細(xì)胞增殖信號檢測

本研究發(fā)現(xiàn)，正常中間球海膽中軸器外層為相對致密的結(jié)締組織，中央為非規(guī)則形狀的中央腔，中央腔外緣組織較為疏松，充滿復(fù)雜的腔隙，其與及等海膽的中軸器組織結(jié)構(gòu)相似(Millott, 1968; Welsch, 1987)，這些特殊結(jié)構(gòu)可能與中軸器的造血功能密切相關(guān)。與此相似，甲殼動物的造血組織由結(jié)締組織包圍，其內(nèi)也存在大量微管、腔隙網(wǎng)絡(luò)等結(jié)構(gòu)(Hose, 1968; Mats, 2000)。本研究發(fā)現(xiàn)，中間球海膽損失體腔細(xì)胞后，中軸器明顯空腔化，其內(nèi)部疏松組織大量消減甚至缺失，外壁上皮細(xì)胞出現(xiàn)崩解現(xiàn)象，向體腔伸出的結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)空泡化。分析可能是由于中軸器內(nèi)儲存的體腔細(xì)胞大量釋放到體腔中，中軸器的中央內(nèi)腔擴(kuò)大、外圍組織皺縮，進(jìn)而使得表皮細(xì)胞層崩解、脫落。24 h后，中軸器內(nèi)部出現(xiàn)明顯的新生組織，說明此時中軸器已開始積極修復(fù)自身的細(xì)胞損失與組織損傷。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，中間球海膽損失體腔細(xì)胞后，中軸器具有由中央腔向外部延伸的通道，而外壁上皮細(xì)胞層與下層結(jié)締組織形成的陷窩部位有細(xì)胞自中軸器向外遷徙，推測與中軸器向圍臟腔釋放體腔細(xì)胞有關(guān)。Millott等(1968)研究認(rèn)為，海膽中軸器具有生產(chǎn)和外泌功能，可將分泌物釋放進(jìn)腔隙陷窩、中央腔、微管或直接從器官的外表面進(jìn)入圍臟腔。因此，中軸器內(nèi)存儲的體腔細(xì)胞也可能通過一些通道及組織表面的直接擴(kuò)散釋放至體腔內(nèi)，或通過腔隙釋放至中央腔內(nèi)，再經(jīng)由未知的通道進(jìn)入體腔。關(guān)于體腔細(xì)胞的釋放途徑和釋放機(jī)制還有待深入研究。

Ki-67蛋白是細(xì)胞周期相關(guān)的一種核蛋白，主要表達(dá)于細(xì)胞增殖分裂的各個時期(G1、S、G2和M期)，但在靜息的細(xì)胞(G0期)中不表達(dá)，常用于檢測腫瘤細(xì)胞的生長指數(shù)。此外，Ki-67蛋白也可用于其他細(xì)胞的增殖檢測，Della Noce等(2019)曾利用Ki-67細(xì)胞增殖蛋白抗體對無脊椎動物扁虱()胚性細(xì)胞系的細(xì)胞增殖情況進(jìn)行相關(guān)研究。本研究通過間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，鼠抗人Ki-67單克隆抗體可與正常海膽中軸器反應(yīng)，但信號較弱，提示正常海膽中軸器中存在低水平的細(xì)胞增殖，以對體腔細(xì)胞的正常消耗進(jìn)行補(bǔ)充，維持機(jī)體平衡。抽取體腔液18 h和24 h后，中軸器中Ki-67信號明顯增強(qiáng)，表明在大量損失體腔細(xì)胞后，中軸器可能啟動了積極的造血程序，細(xì)胞增殖活躍。

綜上所述，本研究確定了中間球海膽體腔液的最大安全抽取量為體質(zhì)量的10%，損失體腔細(xì)胞后，機(jī)體會啟動快速恢復(fù)機(jī)制；中軸器在體腔細(xì)胞大量損失后組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，組織內(nèi)細(xì)胞增殖活動明顯增強(qiáng)。研究結(jié)果為海膽體腔細(xì)胞的造血組織與發(fā)生機(jī)制研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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Recovery Pattern of Coelomocytes after Loss inand Observation of Axial Organ during Recovery Phase

JI Jinlin1,2, MENG Shaodong1,2, WANG Yinan1,2①, DING Jun1, LI Qiang2

(1. Key Laboratory of Mariculture and Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Dalian Ocean University, Dalian, Liaoning 116023, China; 2. Research Center of Aquatic Animal Immunity and Disease, Yancheng Institute of Technology, Yancheng, Jiangsu 224051, China)

Similar to hemocytes in other species, coelomocytes of sea urchins play an important role in the immune system. A verification of the recovery pattern and origin of coelomocytes would be vital in understanding its immune mechanism. Axial organ is a glandular organ that has been thought to be the hemopoietic tissue of sea urchin. Using monoclonal antibodies against coelomocytes, we demonstrated in a previous study that axial organ could serve as a storage tissue of coelomocytesWe further investigated the recovery pattern of coelomocytes in the sea urchinand the changes in the axial organ during the recovery phase. Coelomocyte density was examined at 6 h, 12 h, 18 h, and 24 h after manual extraction of 10% body weight of celomic fluid. Histology of the axial organ was observed, and cell proliferation activity was detected with a monoclonal antibody against Ki-67 (cell proliferation antigen). Results showed that the average coelomocyte density at 6 h was significantly lower than that before extraction; it gradually decreased at 12 h, with a density slightly lower than the initial level, with a recovery value of (92.78±29.40)%. Average coelomocyte was significantly higher than the initial level at 18 h, with a recovery value of (137.08±32.40)%, and was significantly higher than that at 6 h and 12 h (<0.05). Subsequently, the coelomocyte density gradually decreased. The inter-tissue of the axial organ declined and cavitation occurred after coelomocytes were lost. The outer epithelial layer became loose and broke off, and vacuolation was observed in the bulges of the epithelial layer. The inter-tissue increased at 18 h, and newborn tissue appeared clearly at 24 h. Using the Ki-67 antibody, we found a cell production signal in the axial organ from the normal sea urchin and the signal was significantly enhanced after 18 h. Our results indicated that the restoring mechanism of coelomocytes could initiate rapidly after coelomocyte loss, while histological changes and cell production activity enhancement may occur in the axial organ. The present study provides valuable references for further research on the origin and ontogenesis of coelomocytes.

; Coelomocyte; Recovering pattern; Axial organ; Hemopoietic tissue

WANG Yinan, E-mail: 16693762@qq.com

S917.4

A

2095-9869(2021)06-0109-08

10.19663/j.issn2095-9869.20200708001

http://www.yykxjz.cn/

紀(jì)錦霖, 孟少東, 王軼南, 丁君, 李強(qiáng). 中間球海膽體腔細(xì)胞損失后的恢復(fù)規(guī)律及恢復(fù)期中軸器觀察. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2021, 42(6): 109–116

JI J L, MENG S D, WANG Y N, DING J, LI Q. Recovery pattern of coelomocytes after loss inand observation of axial organ during recovery phase. Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(6): 109–116

王軼南，副研究員，E-mail: 16693762@qq.com

2020-07-08,

2020-08-13

*國家自然科學(xué)基金(31402275)和鹽城工學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(XJ201726)共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31402275), and Talent Introduction Project of Yancheng Institute of Technology (XJ201726)].紀(jì)錦霖，E-mail: 840048695@qq.com

(編輯 馬璀艷)