• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    橘色雙冠麗魚黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定*

    2022-01-04 06:31:20宋紅梅周康奇汪學(xué)杰牟希東胡隱昌
    漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展 2021年6期
    關(guān)鍵詞:體色黃色素橘色

    宋紅梅 周康奇 田 雪 汪學(xué)杰 劉 超 劉 奕 牟希東 胡隱昌

    橘色雙冠麗魚黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定*

    宋紅梅1周康奇2田 雪3汪學(xué)杰1劉 超1劉 奕1牟希東1胡隱昌1①

    (1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部休閑漁業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省現(xiàn)代休閑漁業(yè)工程技術(shù)研究中心 廣東 廣州 510380;2. 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶 402460; 3. 河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 河南省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 河南 新鄉(xiāng) 453007)

    為探討橘色雙冠麗魚()黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定方法,觀察魚類色素細(xì)胞生長特征,本研究以橘色雙冠麗魚的尾鰭、鱗片、皮膚組織為材料,在25℃~28℃條件下,分別在胰蛋白酶溶液和膠原酶溶液中消化6h和12h,可有效分離出色素細(xì)胞團(tuán),細(xì)胞懸液經(jīng)氣孔尼龍網(wǎng)過濾后,于35%-45%-55% Percoll試劑中梯度分離和收集黃色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞。采用K-SFM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)和細(xì)胞純化,抑制成纖維細(xì)胞和角朊細(xì)胞的生長,用十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)、雙抗、bFGF的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行色素細(xì)胞傳代培養(yǎng);運(yùn)用巴染色和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài),并用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。結(jié)果顯示,細(xì)胞分離時,黑色素細(xì)胞位于Percoll試劑45%和35%濃度層之間,黃色素細(xì)胞位于Percoll試劑35%濃度層上,2種色素細(xì)胞均凝聚成絮狀。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),黑色素細(xì)胞內(nèi)部含大量黑色素小體,而黃色素細(xì)胞內(nèi)部含喋呤體和類胡蘿卜素囊泡;黑色素細(xì)胞左旋多巴(L-DOPA)染色呈陽性;取第10代色素細(xì)胞進(jìn)行體色相關(guān)基因黑皮素1受體(melanocortin receptor 1,)、酪氨酸酶(tyrosinase,)和()PCR檢測,顯示基因擴(kuò)增條帶特異性強(qiáng),表明獲得的2種色素細(xì)胞具有良好的生物學(xué)活性。本研究建立了橘色雙冠麗魚黃色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定方法,為進(jìn)一步開展魚類體色細(xì)胞分化和體色形成的分子機(jī)理研究提供了細(xì)胞模型。

    橘色雙冠麗魚;色素細(xì)胞;分離;培養(yǎng);鑒定

    體色是魚類獨(dú)特的表型和經(jīng)濟(jì)性狀(Sk?ld, 2013),尤其對于觀賞魚類,體色和斑紋直接決定其觀賞價值和市場價值。魚類體色繁雜多樣、五彩斑斕,深入認(rèn)識魚類體色形成的調(diào)控機(jī)制,尋求人工改良魚類體色的有效途徑,是一個非常值得探索的課題。魚類體色的形成和維持受到一系列細(xì)胞、基因和生理因素的復(fù)雜調(diào)控(Colihueque, 2010),其體色構(gòu)成不僅與色素合成有關(guān),更取決于皮膚、鱗片和鰭條所含色素細(xì)胞的種類、數(shù)量、分布及色素細(xì)胞之間的相互作用(Inaba, 2012)。色素細(xì)胞是魚類體色形成的基本單位和重要載體,目前,已報道魚類至少有黃色素細(xì)胞(xanthophores)、紅色素細(xì)胞(erythrophores)、虹彩細(xì)胞(iridophores)、白色素細(xì)胞(leucophores)、黑色素細(xì)胞(melanophores)、藍(lán)色素細(xì)胞(cyanophores)和紫紅色素細(xì)胞(erythro-iridophores) 7種不同的色素細(xì)胞(徐偉等, 2007; Goda, 2011; Inaba, 2012; Singh, 2015)。

    成功分離和體外培養(yǎng)色素細(xì)胞是探究動物體色相關(guān)基因生物學(xué)功能的基礎(chǔ),也是了解魚類體色形成和體色變異分子機(jī)理的前提(Gola, 2012; Shigeki, 2011)。Eisinger等(1982)通過0.25%胰酶消化處理人包皮組織后,通過添加十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)和霍亂毒素(CT)首次成功分離和體外培養(yǎng)了人的黑色素細(xì)胞;Tamura等(1987)通過人胚胎提取物和TPA,成功從小鼠皮膚獲得黑色素細(xì)胞。此后,研究者也相繼在其他動物皮膚中成功分離黑色素細(xì)胞,如羊駝()(白瑞等, 2013)、烏骨雞()(田穎剛等, 2014)、狐() (鮑加榮, 2015)。但鮮見魚類色素細(xì)胞分離培養(yǎng)的相關(guān)報道。本研究在參考之前哺乳動物等色素細(xì)胞提取研究的基礎(chǔ)上,以具有典型體色褪色過程(黑色–灰色–亮黃色)的橘色雙冠麗魚()為實(shí)驗(yàn)對象,構(gòu)建魚類體表黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定方法,旨在為魚類體色基因功能研究提供細(xì)胞模型,為利用體外培養(yǎng)色素細(xì)胞進(jìn)行魚類色素細(xì)胞分化和體色形成機(jī)理的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    實(shí)驗(yàn)用橘色雙冠麗魚采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所觀賞漁業(yè)研究基地,挑選健碩無傷的魚暫養(yǎng),黑色時期平均體長為(5.0±0.5) cm,黃色時期平均體長為(7.0±0.5) cm,保證日常投喂和正常光照,控制適宜的養(yǎng)殖水溫(23℃~28℃)和充足的溶氧。

    1.2 主要試劑

    K-SFM培養(yǎng)基、DMEM basic (1×)培養(yǎng)基、bFGF (堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、大豆胰蛋白抑制劑均購自Gibco (美國);胰蛋白酶(Typsin 1∶250 for biochemistry)、EDTA(乙二胺四乙酸)、TPA、DNaseⅠ(脫氧核糖核酸酶Ⅰ)、99%胎牛血清(FBS)、膠原酶Ⅰ(CollageⅠ)、DMSO(二甲基亞砜)均購自Sigma公司(美國);左旋多巴(L-DOPA)均購自MCE(美國);牛血清蛋白、Percoll溶液購自Invitrogen公司(美國);新潔爾滅(利爾康,山東);PBS緩沖液、SSC雜交緩沖液(海利克思,上海);RNA提取試劑盒Total RNA kitⅡ購自O(shè)MEGA公司(美國);反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA synthesis kit購自TaKaRa (日本);雙抗原液(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所;其他常規(guī)藥品購自廣州康龍生物科技有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 組織的消化處理與色素細(xì)胞分離 取所需魚鰓放血致死,用0.1%新潔爾滅洗魚體3次,再用75%酒精消毒魚全身。常溫下取所需魚尾鰭、皮膚、鱗片組織,將采集的組織剪碎至1 mm3大小的塊狀,轉(zhuǎn)入50 mL離心管中,加入胰蛋白酶溶液40~45 mL,混勻,25℃~28℃下消化6~8 h。棄胰蛋白酶溶液,用1×PBS在1000 r/min離心沖洗5 min,重復(fù)5次,去除表皮組織碎塊。加入膠原酶溶液混勻,25℃~28℃下消化12~15 h。轉(zhuǎn)入25 μm氣孔尼龍網(wǎng)過濾分裂組織,放置5 min,800 r/min離心8 min,過濾得液體。吸取2 mL細(xì)胞溶液樣品,置于Percoll分層試劑(濃度梯度為55%-45%-35%),1000 r/min離心20~25 min,使色素細(xì)胞分離于不同濃度層。

    1.2.2 色素細(xì)胞的培養(yǎng)、純化與傳代 將分離的色素細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至KCl細(xì)胞培養(yǎng)基中,吹打均勻,取1滴溶液接種于5mL KCl培養(yǎng)基的25mL不透氣培養(yǎng)瓶中,置于28℃培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng),并放入一杯水,保證培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度。

    每3 h觀察原代細(xì)胞生長情況,原代細(xì)胞長至約90%時,去培養(yǎng)液,胰蛋白酶消化,消化后去酶液,加入KC培養(yǎng)基純化細(xì)胞,置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),獲得純化的色素細(xì)胞。

    純化過的基礎(chǔ)原代細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%~90%時,加入MC2培養(yǎng)基,將細(xì)胞重懸,進(jìn)行細(xì)胞傳代。即在新25 mL不透氣培養(yǎng)瓶中加入MC2培養(yǎng)基5mL,加入1滴純化過的細(xì)胞,置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對2~3代細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察比較。

    1.2.3 色素細(xì)胞的顯微觀察鑒定 參考常用黑色素細(xì)胞的DOPA染色法(Wang, 2013),分別取第3代生長旺盛的2種色素細(xì)胞各15mL,加入4%多聚甲醛固定10 min,用1×PBS洗滌3次,加入0.1% L-DOPA溶液,孵育4 h,2 h換液1次,制作細(xì)胞爬片,鑒定色素細(xì)胞的活性和生長情況。

    再各取第3代生長旺盛的2種色素細(xì)胞15 mL,1000 r/min離心3 min,棄上清液,加入1.5 mL 4%戊二醛固定液固定,保存于4℃。在JEM-1400PLUS型透射電子顯微鏡(日本HITACHI)下觀察拍照,分析色素細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

    1.2.4 色素細(xì)胞體色相關(guān)基因PCR鑒定 分別取第10代生長旺盛的2種色素細(xì)胞,用Total RNA KitⅡ(OMEGA)提取RNA,用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA synthesis kit (TaKaRa)合成得到cDNA。

    根據(jù)從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索與橘色雙冠麗魚序列及相關(guān)同源物種的基因,采用Primer Premier 6.0進(jìn)行PCR引物設(shè)計(表1),引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。以2種色素細(xì)胞提取RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,利用3對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系(50 μL):ddH2O 32.5μL,10×buffer 5 μL,dNTPs 8μL,模板cDNA (200 ng/μL) 2 μL,酶0.5 μL,正反向引物(10μmol/L)各1 μL。PCR參數(shù):94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,退火60 s (退火溫度見表1),72℃延伸30 s,共30個循環(huán);72℃延伸7 min。電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

    表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

    2 結(jié)果

    2.1 橘色雙冠麗魚色素細(xì)胞分離、培養(yǎng)和觀察

    2.1.1 色素細(xì)胞提取 以2個典型褪色時期“黑色期和黃色期”橘色雙冠麗魚為材料,提取獲得的2種色素細(xì)胞均保持原有顏色(圖1A)。通過Percoll試劑55%-45%-35%濃度梯度離心分層,黑色素細(xì)胞位于梯度層的45%~35%之間(圖1B箭頭b所指),而黃色素細(xì)胞位于35%濃度層上(圖1B箭頭a所指)。取2種色素置于同一Percoll濃度梯度試劑離心,2種色素細(xì)胞均能明顯分離和分層,黑色素細(xì)胞在下層(圖1C箭頭b所指),位于45%~35%之間,黃色素細(xì)胞位于35%濃度層表面(圖1C箭頭a所指)。

    圖1 橘色雙冠麗魚色素細(xì)胞分離

    2.1.2 分離培養(yǎng)后色素細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較觀察 初步分離的2種色素細(xì)胞均凝聚呈絮狀,形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),絮狀物各自分布了大量黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞(圖2A、2B);低倍鏡下觀察培養(yǎng)的第1代色素細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)黑色素細(xì)胞呈球狀,有零星色素顆粒散落出細(xì)胞外(圖2C),而黃色素色素細(xì)胞全部為單個色素個體,分布在培養(yǎng)基表面。黃色素細(xì)胞在培養(yǎng)前期,細(xì)胞小,單個不聚攏(圖2D、2E);經(jīng)過培養(yǎng),細(xì)胞迅速生長,6~12 h覆蓋培養(yǎng)基表面約70%后細(xì)胞個體變大,慢慢聚攏;過夜培養(yǎng)至覆蓋培養(yǎng)基表面約90%時,大個體色素細(xì)胞聚攏(圖2F),與在鱗片上直接觀察到的色素細(xì)胞形狀大小基本一致。

    2.1.3 橘色雙冠麗魚體表色素細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 為與分離培養(yǎng)的色素細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行對比,分別從橘色雙冠麗魚“黑色–灰色–黃色”體色過渡期魚體上取下背部鱗片進(jìn)行色素細(xì)胞觀察,發(fā)現(xiàn)黑色魚體上的色素細(xì)胞占絕大比例,黑色素細(xì)胞單個成簇狀,有分散和聚攏2種形態(tài)(圖3A)?;疑~體上色素細(xì)胞數(shù)量少,個體小,有黑色和黃色色素同時存在,黑色素細(xì)胞顏色較黑色魚體鱗片上的淺,為棕色,細(xì)胞個體也較小;出現(xiàn)的黃色素細(xì)胞為彌散狀,分布于黑色素細(xì)胞下層,色素細(xì)胞不顯現(xiàn)完整清晰的形狀(圖3B)。黃色魚體上基本無黑色素細(xì)胞,有數(shù)量較多、個體較大的黃色素細(xì)胞,有的細(xì)胞顏色較深且偏紅,呈凝聚狀,類似于紅色素細(xì)胞(圖3C)。

    圖2 橘色雙冠麗魚色素細(xì)胞培養(yǎng)后形態(tài)學(xué)觀察

    圖3 橘色雙冠麗魚鱗片色素細(xì)胞

    2.2 2種色素細(xì)胞的顯微觀察與生物學(xué)鑒定

    2.2.1 L-DOPA染色鑒定黑色素細(xì)胞酶的活性 取第3代生長旺盛的黑色素細(xì)胞進(jìn)行L-DOPA染色,在顯微鏡下觀察黑素細(xì)胞染色情況,可見斑點(diǎn)狀黑色或灰色黑色素細(xì)胞,L-DOPA染色呈陽性(圖4B)。黃色素細(xì)胞沒有多巴染色,還未見黃色素細(xì)胞酶活性的方法,只能從顯微鏡下觀察其生長情況。

    2.2.2 透射電鏡分析 通過透射電鏡觀察黑色素細(xì)胞,可見其內(nèi)部含大量的黑色素小體(圖5A)。電鏡下,觀察到黃色素細(xì)胞內(nèi)部的喋呤體(圖5箭頭所指a)和類胡蘿卜素囊泡(圖5箭頭所指b),細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整。

    2.2.3 2種色素細(xì)胞和基因的PCR檢測 第10代生長旺盛的黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞和的PCR檢測結(jié)果顯示,擴(kuò)增條帶特異性良好(圖6),說明獲得的黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞均保持著較好的生物活性。

    圖4 橘色雙冠麗魚黑色素細(xì)胞的L-DOPA染色

    圖5 電鏡觀察黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)

    3 分析與討論

    在細(xì)胞分離培養(yǎng)中,運(yùn)用不同消化酶對組織進(jìn)行消化處理是影響細(xì)胞提取效果的重要因素,在常用的幾種組織消化酶中,DispaseⅡ酶對皮膚組織消化相對較弱,多應(yīng)用于哺乳動物眼睛黑色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)(鮑加榮, 2015);中性蛋白酶可選擇性作用于纖維蛋白、黏連蛋白和Ⅳ型膠原,破環(huán)板橋內(nèi)的結(jié)構(gòu),但對于橋粒結(jié)構(gòu)作用卻很少,很難將表皮完全分散;胰蛋白酶能水解細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì),破環(huán)細(xì)胞間的半橋粒和橋粒結(jié)構(gòu),從而使細(xì)胞分散;膠原酶Ⅰ作用于結(jié)締組織中的膠原蛋白,對細(xì)胞間質(zhì)產(chǎn)生消化作用,且對細(xì)胞本身影響不大,能使細(xì)胞保持高活力(田穎剛等, 2014; 鮑加榮, 2015)。本研究參考Inaba等(2012)的方法并改進(jìn),在25℃~28℃下用2.5 mg/mL的胰蛋白酶消化組織6~8 h,去除表皮細(xì)胞,再用0.1 mg/mL膠原酶Ⅰ配制的溶液進(jìn)行二次消化12~15 h,可分離獲得活性較高的色素細(xì)胞原液。分離的2種色素細(xì)胞在Percoll梯度試劑中低速離心后分層明顯,細(xì)胞層間隔35%的Percoll試劑層,推測黑色素細(xì)胞較黃色素細(xì)胞質(zhì)量重,確定2種色素細(xì)胞分離時所在Percoll試劑濃度層,可為下一步實(shí)驗(yàn)得到培養(yǎng)純化細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

    圖6 色素細(xì)胞中TYR、EDNRB和MC1R基因的PCR片段擴(kuò)增

    色素細(xì)胞體外培養(yǎng)一般采用K-SFM角朊細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM、M199等,比較K-SFM和DMEM/F12 2種培養(yǎng)基對羊駝毛囊干細(xì)胞生長和增殖的影響,發(fā)現(xiàn)K-SFM培養(yǎng)基更有利于毛囊干細(xì)胞增殖,培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)量多、增殖快,克隆生成能力更強(qiáng)(弓慧敏等, 2016)。田穎剛等(2014)以K-SFM培養(yǎng)基為原代培養(yǎng)和細(xì)胞純化,以DMEM培養(yǎng)基為最終傳代培養(yǎng),成功建立烏骨雞黑色素細(xì)胞系。本研究借鑒哺乳動物和鳥類(Deveci, 2001)的培養(yǎng)方法加以改進(jìn),采用能抑制成纖維細(xì)胞和角朊細(xì)胞生長的K-SFM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)和細(xì)胞純化,以DMEM培養(yǎng)基為最終傳代培養(yǎng),獲得生理狀態(tài)良好的色素細(xì)胞。

    魚類的鱗片、皮膚和尾鰭有很多膠原纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞,數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞,因此,色素細(xì)胞培養(yǎng)中,雜細(xì)胞的去除非常關(guān)鍵,培養(yǎng)基中添加促癌因子TPA可對不同細(xì)胞產(chǎn)生選擇性毒性作用。TPA能促進(jìn)色素細(xì)胞分泌特定的生長因子,促進(jìn)細(xì)胞的生長、粘附和增殖,抑制成纖維細(xì)胞及角質(zhì)形成,達(dá)到避免成纖維細(xì)胞和膠質(zhì)污染,從而獲得純化的色素細(xì)胞(Yaar, 1991)。因此,本研究在原代培養(yǎng)和細(xì)胞純化時,增大TPA用量(10 ng/mL),但傳代培養(yǎng)時,應(yīng)減少TPA用量(1 ng/mL),以減少對2種色素細(xì)胞的毒性作用。

    本研究在鱗片上直接觀察到的黑、黃2種色素細(xì)胞個體分明,成群地分布在鱗片上,而提取到的2種色素細(xì)胞在低倍鏡下觀察呈絮狀,但也能看到一些單個的色素細(xì)胞,為判定所提取的色素細(xì)胞有無破裂、有無增殖能力及生物活性狀況等,對色素細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后顯微觀察,發(fā)現(xiàn)2種色素細(xì)胞均能正常生長,其中,黃色素細(xì)胞迅速生長,細(xì)胞個體變大后,慢慢聚攏成球狀。通過多巴染色和透射電鏡來觀察黑色素小體是鑒定黑色素細(xì)胞的經(jīng)典方法(Deveci, 2001; Fuller, 2001; Hu, 2007)。多巴染色培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞呈現(xiàn)陽性反應(yīng),高倍透射電鏡觀察黑色素細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),顯現(xiàn)大量黑色素小體;黃色素細(xì)胞內(nèi)部可見喋呤體和類胡蘿卜素囊泡,2種色素細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)與在大麻哈魚(Walbaum)皮膚表面通過電鏡觀察到的狀態(tài)相似(Djurdjevi?, 2015),佐證本研究所建立的提取、分離和體外培養(yǎng)橘色雙冠麗魚體表黑、黃2種色素細(xì)胞方法的可行性。

    魚類體色的分布和形成主要由表現(xiàn)為黑色、棕色表型的真黑色素和表現(xiàn)為黃色、紅色表型的褐黑色素2種黑色素的相對數(shù)量及分布決定,二者均源于黑色素合成信號通路,都在酪氨酸基因()的調(diào)控下表達(dá)(Lin, 2007; 王成輝, 2012)。而基因和基因在黑色素合成通路中起著類似于“開關(guān)”的作用(Adalsteinsson, 1987; 蔣燕玲等, 2016)。在色素細(xì)胞發(fā)育中,基因能促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞的增殖,調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴細(xì)胞分化為色素細(xì)胞(Parichy, 2000)。因此,本研究從黑、黃2種色素細(xì)胞中提取總RNA,檢測色素細(xì)胞中體色關(guān)鍵基因和的表達(dá),發(fā)現(xiàn)均能擴(kuò)增出特異性條帶,表明獲得的黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞具有良好的生物學(xué)狀態(tài)。

    本研究利用Percoll梯度試劑分離橘色雙冠麗魚黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞,以K-SFM培養(yǎng)基(添加10 ng/mL TPA)進(jìn)行原代和純化培養(yǎng),最后培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基,并添加1 ng/mL TPA、20 ng/mL bFGF和1%雙抗的完全培養(yǎng)基中,建立了2種色素細(xì)胞的培養(yǎng)體系,并利用形態(tài)觀察、多巴染色、透射電鏡觀察和體色相關(guān)基因表達(dá)對培養(yǎng)細(xì)胞的特性進(jìn)行研究,為進(jìn)一步構(gòu)建橘色雙冠麗魚黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞系奠定基礎(chǔ),為了解魚類色素細(xì)胞發(fā)育、體色形成及相關(guān)基因功能等提供參考。

    ADALSTEINSSON S, HERSTEINSSON P, GUNNARSSON E. Fox colors in relation to colors in mice and sheep. Journal of Heredity, 1987, 78(4): 235–237

    BAI R, YU Z H, FAN R W,. Culture, identification of alpaca skin melanocytes in vitro. Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences, 2013, 44(4): 549–556 [白瑞, 于志慧, 范瑞文, 等. 羊駝皮膚黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)鑒定. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2013, 44(4): 549–556]

    BAO J R. Analyzing coat color differences between red and silver fox (), pigment genes cloning and tentative functional investigation of TYRP1. Doctoral Dissertation of Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2015 [鮑加榮. 赤狐和銀黑狐毛色差異分析、色素基因克隆及TYRP1功能初步研究. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士研究生學(xué)位論文, 2015]

    COLIHUEQUE N. Genetics of salmonid skin pigmentation: Clues and prospects for improving the external appearance of farmed salmonids. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 2010, 20(1): 71–86

    DEVECI M, GILMONT R R, TERASHI H,. Melanocyte- conditioned medium stimulates while melanocyte/keratinocyte contact inhibits keratinocyte proliferation. Journal of Burn Care and Rehabilitation, 2001, 22(1): 9–14

    DJURDJEVI? I, KREFT M E, SU?NIK B S. Comparison of pigment cell ultrastructure and organisation in the dermis of marble trout and brown trout, and first description of erythrophore ultrastructure in salmonids., 2015, 227(5): 583–595

    EISINGER M, MARKO O. Selective proliferation of normal human melanocytesin the presence of phorbol ester and cholera toxin., 1982, 79(6): 2018–2022

    FULLER B B, SPAULDING D T, SMITH D R. Regulation of the catalytic activity of preexisting tyrosinase in black and Caucasian human melanocyte cell cultures., 2001, 262(2): 197–208

    GODA M, OHATA M, IKOMA H,. Integumental reddish-violet coloration owing to novel dichromatic chromatophores in the teleost fish,. Pigment Cell and Melanoma Research, 2011, 24(4): 614–617

    GOLA M, CZAJKOWSKI R, BAJEK A,. Melanocyte stem cells: Biology and current aspects. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research, 2012, 18(10): A155–A159

    GONG H M, BAI R, JIA Z F,. Effect of two kinds of culture medium on the alpaca hair follicle stem cell growth and proliferation. Journal of Shanxi Medical University, 2016, 47(5): 424–428 [弓慧敏, 白瑞, 賈宗菲, 等. 兩種培養(yǎng)基對羊駝毛囊干細(xì)胞生長和增殖的影響. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2016, 47(5): 424–428]

    HU D N, MCCORMICK S A, SEEDOR J A,. Isolation, purification and cultivation of conjunctival melanocytes., 2007, 84(4): 662

    INABA M, YAMANAKA H, KONDO S. Pigment pattern formation by contact-dependent depolarization. Science, 2012, 335(6069): 677

    JIANG Y L, SONG H M, LIU Y,. Cloning and expression analysis of the developing sequence and tissue expression of TYR gene in. Journal of Agricultural Biotechnology, 2016, 24(5): 697–707 [蔣燕玲, 宋紅梅, 劉奕, 等. 橘色雙冠麗魚TYR基因的克隆及其發(fā)育時序和組織表達(dá)分析. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2016, 24(5): 697–707]

    LIN J Y, FISHER D E. Melanocyte biology and skin pigmentation. Nature, 2007, 445(7130): 843–850

    PARICHY D M, MELLGREN E M, RAWLS J F,. Mutational analysis of endothelin receptor b1 (rose) during neural crest and pigment pattern development in the zebrafish., 2000, 227(2): 294–306

    SHIGEKI O, YOICHI I, YOHEI O,. Generation of human melanocytes from induced pluripotent stem cells. PLoS One, 2011, 6(1): e16182

    SINGH A P, NüSSLEIN-VOLHARD C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation., 2015, 25(2): R81–R92

    SK?LD H N, ASPENGREN S, WALLIN M. Rapid color change in fish and amphibians: Function, regulation, and emerging applications. Pigment Cell and Melanoma Research, 2013, 26(1): 29–38

    TAMURA A, HALABAN R, MOELLMANN G,. Normal murine melanocytes in culture. In Vitro Cellular and Developmental Biology, 1987, 23(7): 519–522

    TIAN Y G, LIAO C Y, XU D L. Primary culture and identification of skin melanocytes from black-bone silky fowl (Domesticus Brisson). China Poultry, 2014, 36(12): 6–10 [田穎剛, 廖春艷, 徐德利. 烏骨雞皮膚黑色素細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定. 中國家禽, 2014, 36(12): 6–10]

    WANG C H. Brief summary on genetic basis of pigmentation in fish. Journal of Shanghai Ocean University, 2012, 21(5): 103–108 [王成輝. 魚類體色變異的遺傳基礎(chǔ)研究進(jìn)展簡述. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 2012, 21(5): 103–108]

    WANG D, XU X, MA H,. Optimization of the method for the culture of melanocyte precursors from hair follicles and their activation by 1, 25-dihydroxyvitamin D3. Experimental and Therapeutic Medicine, 2013, 6(4): 967–972

    XU W, LI C T, CAO D C,. Observation on scale chromatophore and body colors' genesis of carp and cruscian carp. Acta Hydrobiologica Sinica, 2007, 31(1): 67–72 [徐偉, 李池陶, 曹頂臣, 等. 幾種鯉鯽鱗片色素細(xì)胞和體色發(fā)生的觀察. 水生生物學(xué)報, 2007, 31(1): 67–72]

    YAAR M, GILCHREST B A. Human melanocyte growth and differentiation: A decade of new data. Journal of Investigative Dermatology, 1991, 97(4): 611–617

    Isolation, Culture and Identification of Polychromatic Midas cichlids () Melanophores and Xanthophores

    SONG Hongmei1, ZHOU Kangqi2, TIAN Xue3, WANG Xuejie1, LIU Chao1, LIU Yi1, MU Xidong1, HU Yinchang1①

    (1. Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Leisure Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Guangdong Modern Leisure Fisheries Engineering Technology Research Center, Guangzhou, Guangdong 510380, China; 2. China Southwest University, Key Laboratory of Freshwater Fish Resources and Reproductive Development, Ministry of the Ministry of Education, Chongqing 402460, China; 3. College of Fisheries, Engineering Technology Research Center of Henan Province for Aquatic Animal Cultivation, Henan Normal University, Xinxiang, Henan 453007, China)

    This study aimed to investigate the methods of isolation, culture, and identification of melanophores and xanthophores in polychromatic midas cichlids () and to thus observe the growth characteristics of pigment cells in fish. In this study, the caudal fin, scales, and skin tissues ofwere used as the experimental material. To separate the pigment cells, the tissues were digested in trypsin solution and collagenase solution for 6 h and 12 h, respectively,at 25℃~28℃. After the cell suspension was filtered through a stoma nylon net, xanthophores and melanocytes were separated and collected by means of 35%-45%-55% Percoll multilayer density gradient centrifugation. K-SFM medium was used for primary cell culture and cell purification to inhibit the growth of fibroblasts and keratinocytes. DMEM supplemented with phorbol ester (TPA), double resistance, and bEGF,., was used for the subculture of pigment cells. The morphology of the cells was observed by L-DOPA staining and transmission electron microscopy, and the cells were identified by molecular markers. The results showed that when the cells were separated, the melanocytes were located at the boundary of the 45% and 35% Percoll reagent layers, while xanthophores were located on top of the 35% Percoll layer. Both pigment cells condensed into flocculation. Transmission electron microscopy showed that the melanocytes contained a large number of melanosomes, while the yellow cells contained the MTX and carotenoid vesicles. The melanocytes were positive under L-DOPA staining. The 10th generation of pigment cells was used for PCR detection of the body color related genes,, and, which showed strong specificity of gene amplification bands, indicating that the two pigment cells obtained had good biological activity.In this study, methods for the isolation, culture, and identification of melanophores and xanthophores of polychromatic midas cichlids were successfully established, providing a cell model for further research on the molecular mechanisms of body color cell differentiation and body color formation in fish.

    ; Pigment cell; Separation; Cultivation; Identification

    HU Yinchang, E-mail: huyc22@163.com

    S917.4

    A

    2095-9869(2021)06-0053-08

    10.19663/j.issn2095-9869.20200617001

    http://www.yykxjz.cn/

    宋紅梅, 周康奇, 田雪, 汪學(xué)杰, 劉超, 劉奕, 牟希東, 胡隱昌. 橘色雙冠麗魚黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2021, 42(6): 53–60

    SONG H M, ZHOU K Q, TIAN X, WANG X J, LIU C, LIU Y, MU X D, HU Y H. Isolation, culture and identification of polychromatic midas cichlids () melanophores and xanthophores. Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(6): 53–60

    胡隱昌,研究員,E-mail: huyc22@163.com

    2020-06-17,

    2020-08-20

    *國家自然科學(xué)基金青年基金(802037)、廣東省自然科學(xué)基金(2020A1515010304)和廣州市科技計劃項(xiàng)目(202002030047)共同資助[This work was supported by the National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (802037),(2020A1515010304), and(202002030047)]. 宋紅梅,E-mail: shm1227@126.com

    (編輯 馮小花)

    猜你喜歡
    體色黃色素橘色
    不同體色虎龍雜交斑的生理特性比較
    樂坦?注射用紅花黃色素
    為什么大多數(shù)橘色貓是公的?
    紅花黃色素治療嚴(yán)重膿毒癥患者的心肌損傷
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:25
    我把所有橘色的事物叫作溫暖
    中國詩歌(2016年6期)2016-11-25 23:54:04
    蚜蟲的生存適應(yīng)性研究進(jìn)展
    只是橘色仍溫柔
    紅花黃色素注射液治療冠心病療效觀察
    誘人的甜美
    女友·家園(2015年2期)2015-02-25 17:47:38
    幾種不同品系暹羅斗魚體色遺傳規(guī)律的初步研究
    久久久久久久久中文| 999久久久精品免费观看国产| 丝袜在线中文字幕| 男人舔女人下体高潮全视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲人成网站高清观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产在线观看jvid| 91av网站免费观看| 狂野欧美激情性xxxx| 一区二区三区国产精品乱码| 妹子高潮喷水视频| avwww免费| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 中文在线观看免费www的网站 | 最好的美女福利视频网| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 成人三级做爰电影| 美女国产高潮福利片在线看| 久久99热这里只有精品18| 欧美zozozo另类| 亚洲成国产人片在线观看| 久久久久久久久中文| 成人一区二区视频在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲成人国产一区在线观看| tocl精华| 亚洲 欧美一区二区三区| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 青草久久国产| 免费在线观看日本一区| 亚洲全国av大片| 哪里可以看免费的av片| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 在线观看舔阴道视频| www.自偷自拍.com| 极品教师在线免费播放| 精品欧美一区二区三区在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产免费男女视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产单亲对白刺激| 欧美乱色亚洲激情| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品九九99| 一夜夜www| 国产区一区二久久| 国产成+人综合+亚洲专区| 最好的美女福利视频网| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 最新在线观看一区二区三区| 免费无遮挡裸体视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 51午夜福利影视在线观看| 性欧美人与动物交配| 搡老熟女国产l中国老女人| 色在线成人网| 中亚洲国语对白在线视频| 国产成人啪精品午夜网站| 色老头精品视频在线观看| 午夜影院日韩av| 国产亚洲精品久久久久5区| 性欧美人与动物交配| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 最近在线观看免费完整版| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日韩欧美免费精品| 校园春色视频在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 麻豆av在线久日| 伦理电影免费视频| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 午夜福利成人在线免费观看| 国产精品免费视频内射| 亚洲精品色激情综合| 亚洲五月婷婷丁香| 国产1区2区3区精品| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久精品影院6| 日本一区二区免费在线视频| 一级毛片高清免费大全| 午夜福利欧美成人| 午夜福利视频1000在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 悠悠久久av| 男人舔女人下体高潮全视频| 老司机在亚洲福利影院| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久亚洲精品不卡| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲五月天丁香| 在线观看日韩欧美| 欧美中文综合在线视频| 免费观看精品视频网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲午夜理论影院| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国内精品久久久久久久电影| av免费在线观看网站| 免费av毛片视频| 大香蕉久久成人网| 亚洲av片天天在线观看| 在线视频色国产色| 国产精华一区二区三区| 久久 成人 亚洲| av中文乱码字幕在线| 两个人视频免费观看高清| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 999久久久精品免费观看国产| 国产一区二区激情短视频| 久久这里只有精品19| 美国免费a级毛片| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 一边摸一边抽搐一进一小说| 成人一区二区视频在线观看| 午夜影院日韩av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美久久黑人一区二区| 国产三级在线视频| 久久久久九九精品影院| netflix在线观看网站| 搡老岳熟女国产| 免费看十八禁软件| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲国产精品sss在线观看| 夜夜爽天天搞| 欧美最黄视频在线播放免费| 一区福利在线观看| bbb黄色大片| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产国语露脸激情在线看| 国产伦在线观看视频一区| 久久狼人影院| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产精品免费视频内射| 久久久精品欧美日韩精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品不卡国产一区二区三区| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲avbb在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 午夜久久久在线观看| 香蕉久久夜色| 香蕉av资源在线| 国产真实乱freesex| 中文字幕高清在线视频| 精品国产美女av久久久久小说| 禁无遮挡网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| 哪里可以看免费的av片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久中文字幕一级| 久久热在线av| 在线视频色国产色| 高清毛片免费观看视频网站| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产又色又爽无遮挡免费看| 免费在线观看黄色视频的| 老司机深夜福利视频在线观看| 欧美午夜高清在线| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品国产国语对白av| 久久狼人影院| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲无线在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久欧美精品欧美久久欧美| a在线观看视频网站| 国内精品久久久久精免费| 国产野战对白在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美乱码精品一区二区三区| 长腿黑丝高跟| 日韩有码中文字幕| 国产精品永久免费网站| 青草久久国产| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲午夜理论影院| 亚洲精品一区av在线观看| 久久久久久久午夜电影| 国产成人影院久久av| 日韩欧美在线二视频| 麻豆一二三区av精品| 自线自在国产av| 色综合站精品国产| 国产视频内射| 国产免费男女视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产爱豆传媒在线观看 | 男女午夜视频在线观看| 亚洲av成人av| 一区二区三区精品91| 国产亚洲欧美精品永久| 婷婷精品国产亚洲av| av欧美777| 满18在线观看网站| 婷婷丁香在线五月| 韩国av一区二区三区四区| 日韩欧美 国产精品| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 91国产中文字幕| 国产成人av激情在线播放| 国产99白浆流出| 国产成年人精品一区二区| 国产色视频综合| 久久青草综合色| 久久精品91蜜桃| 欧美午夜高清在线| 一级作爱视频免费观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| avwww免费| 欧美在线一区亚洲| 免费在线观看黄色视频的| 中文字幕高清在线视频| 好男人电影高清在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 这个男人来自地球电影免费观看| 正在播放国产对白刺激| 国产视频一区二区在线看| 国产精品久久久久久精品电影 | 看黄色毛片网站| 国产精品国产高清国产av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 久久久久久久午夜电影| 精品一区二区三区四区五区乱码| 99国产精品一区二区三区| 日本 av在线| a在线观看视频网站| 久久 成人 亚洲| 美女免费视频网站| 亚洲精华国产精华精| 久久青草综合色| 日本五十路高清| 久久精品国产亚洲av高清一级| √禁漫天堂资源中文www| 精品国产亚洲在线| 亚洲精品美女久久av网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美国产精品va在线观看不卡| 搡老岳熟女国产| 老鸭窝网址在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲成人久久性| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 视频在线观看一区二区三区| 国产日本99.免费观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲美女黄片视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久久久人人人人人| 免费搜索国产男女视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 午夜免费成人在线视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久国产精品人妻蜜桃| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 欧美黑人巨大hd| 久久久久久久久免费视频了| 午夜视频精品福利| 国产午夜精品久久久久久| 免费在线观看亚洲国产| 少妇熟女aⅴ在线视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 成人亚洲精品一区在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 人人妻人人澡人人看| 级片在线观看| 久热爱精品视频在线9| 久久久水蜜桃国产精品网| 成年免费大片在线观看| 成年版毛片免费区| 天堂动漫精品| 精品无人区乱码1区二区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 婷婷六月久久综合丁香| tocl精华| 免费一级毛片在线播放高清视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 俄罗斯特黄特色一大片| 成人国语在线视频| 久热爱精品视频在线9| 国产欧美日韩精品亚洲av| 女人被狂操c到高潮| 在线观看舔阴道视频| 亚洲激情在线av| 好男人在线观看高清免费视频 | 亚洲久久久国产精品| 欧美乱妇无乱码| 在线国产一区二区在线| 国产成人系列免费观看| 夜夜爽天天搞| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日韩视频一区二区在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 美女 人体艺术 gogo| av电影中文网址| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 老鸭窝网址在线观看| 看免费av毛片| av中文乱码字幕在线| 这个男人来自地球电影免费观看| 窝窝影院91人妻| 啦啦啦免费观看视频1| www.www免费av| 国产伦在线观看视频一区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲av成人av| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 成年版毛片免费区| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产午夜福利久久久久久| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 悠悠久久av| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产激情久久老熟女| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲第一青青草原| 99久久国产精品久久久| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 狂野欧美激情性xxxx| 国产精品1区2区在线观看.| 男女床上黄色一级片免费看| 免费在线观看亚洲国产| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 99re在线观看精品视频| 99在线视频只有这里精品首页| 中文字幕高清在线视频| 久久亚洲精品不卡| 18禁黄网站禁片午夜丰满| av免费在线观看网站| 嫩草影院精品99| 久久国产精品人妻蜜桃| 18禁观看日本| 日韩欧美免费精品| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲全国av大片| 十八禁人妻一区二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 一进一出抽搐动态| 欧美不卡视频在线免费观看 | 免费高清在线观看日韩| 99久久国产精品久久久| 免费观看精品视频网站| 国产一区在线观看成人免费| 长腿黑丝高跟| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲无线在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲av第一区精品v没综合| 国内精品久久久久精免费| 色在线成人网| 真人一进一出gif抽搐免费| www日本在线高清视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 女人被狂操c到高潮| 亚洲精品在线美女| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产99久久九九免费精品| avwww免费| 国产麻豆成人av免费视频| 麻豆成人av在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美最黄视频在线播放免费| www日本黄色视频网| 欧美日韩福利视频一区二区| 中文资源天堂在线| 99re在线观看精品视频| 国产色视频综合| 一本综合久久免费| 香蕉av资源在线| 亚洲免费av在线视频| 国产视频一区二区在线看| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品久久久久久久末码| 亚洲一区二区三区不卡视频| 变态另类丝袜制服| 最新在线观看一区二区三区| 老司机靠b影院| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲av片天天在线观看| 久久99热这里只有精品18| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 黄色 视频免费看| 日韩欧美免费精品| 亚洲avbb在线观看| 日本五十路高清| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 人人妻人人看人人澡| 亚洲成人国产一区在线观看| 91麻豆av在线| 好男人电影高清在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲第一电影网av| 久久久久久九九精品二区国产 | 日韩高清综合在线| 真人做人爱边吃奶动态| 88av欧美| 国产激情久久老熟女| 亚洲精品在线观看二区| 一区二区三区精品91| 无限看片的www在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品久久蜜臀av无| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲国产精品成人综合色| 一区二区三区国产精品乱码| 国产主播在线观看一区二区| 免费在线观看成人毛片| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲第一青青草原| 大型av网站在线播放| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品综合久久久久久久免费| 大型av网站在线播放| 精品国产国语对白av| 亚洲国产看品久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 中文亚洲av片在线观看爽| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产亚洲欧美98| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日本在线视频免费播放| 男人舔奶头视频| 免费看美女性在线毛片视频| 我的亚洲天堂| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 一a级毛片在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 精品人妻1区二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 一二三四社区在线视频社区8| 国内精品久久久久久久电影| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 久久久国产成人免费| 欧美精品啪啪一区二区三区| 深夜精品福利| 国产精品亚洲av一区麻豆| 999精品在线视频| tocl精华| 国产视频一区二区在线看| 日韩av在线大香蕉| 老司机深夜福利视频在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 成人精品一区二区免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美一级a爱片免费观看看 | 99在线人妻在线中文字幕| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 性欧美人与动物交配| 身体一侧抽搐| 日韩大码丰满熟妇| 老司机深夜福利视频在线观看| 波多野结衣高清作品| 日韩大尺度精品在线看网址| 岛国视频午夜一区免费看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 黄片小视频在线播放| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产私拍福利视频在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 在线视频色国产色| 日韩有码中文字幕| 亚洲精品在线美女| 老鸭窝网址在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| www.www免费av| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产成人精品久久二区二区91| 不卡av一区二区三区| 久久亚洲真实| 国产精品亚洲一级av第二区| 1024视频免费在线观看| 亚洲色图av天堂| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美在线一区亚洲| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久中文字幕一级| 中文资源天堂在线| 满18在线观看网站| 在线观看66精品国产| 午夜福利视频1000在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲成人久久爱视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 一本精品99久久精品77| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 日韩欧美在线二视频| 免费av毛片视频| 精品久久久久久久久久久久久 | 最近在线观看免费完整版| 欧美三级亚洲精品| 久久九九热精品免费| 亚洲三区欧美一区| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 不卡一级毛片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| e午夜精品久久久久久久| 在线视频色国产色| 精品久久久久久成人av| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 变态另类丝袜制服| 国产亚洲精品av在线| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 婷婷精品国产亚洲av| 久久九九热精品免费| www.自偷自拍.com| 亚洲成国产人片在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 91成人精品电影| 久久久久国产一级毛片高清牌| 在线观看一区二区三区| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲,欧美精品.| 啦啦啦韩国在线观看视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 我的亚洲天堂| 欧美黑人欧美精品刺激| 免费观看精品视频网站| videosex国产| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 99久久99久久久精品蜜桃| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品乱码一区二三区的特点| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产午夜福利久久久久久| 无人区码免费观看不卡| 亚洲国产精品999在线| 国产久久久一区二区三区| 国产精品二区激情视频| 亚洲国产欧美网| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 精品国产国语对白av| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产成人av教育| 国产又色又爽无遮挡免费看| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久久久久大精品| 色老头精品视频在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 欧美激情高清一区二区三区| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产熟女午夜一区二区三区| 男女午夜视频在线观看| 日本在线视频免费播放| 免费观看人在逋| 午夜视频精品福利| 91大片在线观看| 人成视频在线观看免费观看|