靜態(tài)頂空氣相色譜法測(cè)定原料藥硫酸氫氯吡格雷有機(jī)殘留溶劑

羅忠華，文景兵

(東陽(yáng)光藥業(yè)研究院，中國(guó)東莞 523871)

硫酸氫氯吡格雷(Clopidogrel Bisulfate)是一種新型的抗血小板聚集藥物，是法國(guó)Sanofi-Aventis 公司研制的血小板聚集抑制劑，1998年首次在美國(guó)和英國(guó)上市，臨床上廣泛用于治療心臟病、中風(fēng)、確診的外周血管疾?。?-2］，特別是聯(lián)合其他藥物臨床上報(bào)道較多［3-6］，對(duì)心腦血管的預(yù)防與治療取得了很好的療效.化學(xué)合成藥的生產(chǎn)工藝中不可避免地使用各類溶劑，當(dāng)藥品中所含的殘留溶劑水平高于安全值時(shí)，對(duì)人體或環(huán)境將產(chǎn)生危害［7-8］，人用藥品注冊(cè)技術(shù)規(guī)范國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)與各國(guó)藥典對(duì)藥品中殘留溶劑的限度水平做出了嚴(yán)格的規(guī)定，殘留溶劑的檢測(cè)與控制是原料藥質(zhì)量研究的重點(diǎn)與難點(diǎn).目前殘留溶劑的檢測(cè)主要采用氣相色譜法，其中又以靜態(tài)頂空氣相色譜法應(yīng)用最為廣泛［9-12］.原料藥硫酸氫氯吡格雷的合成工藝中使用了甲醇、丙酮、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸異丙酯和甲苯等8 種溶劑，故本文按《中國(guó)藥典》2010年版(二部)殘留溶劑測(cè)定法(Ch.P.2010 二部附錄VIII P)［13］與ICH 相關(guān)要求，開發(fā)了靜態(tài)頂空氣相色譜法同時(shí)測(cè)定原料藥硫酸氫氯吡格雷中甲醇、丙酮、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸異丙酯和甲苯8 種溶劑殘留量，所用溶劑經(jīng)濟(jì)環(huán)保，方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜儀(Agilent 公司7890A)，配氫火焰離子檢測(cè)器;靜態(tài)頂空色譜儀(Agilent 公司7697A);20 mL頂空瓶(Agilent 公司).二甲基亞砜(DMSO，色譜純，德國(guó)默克公司);N，N-二甲基甲酰胺(DMF，色譜純，德國(guó)默克公司);甲醇、丙酮、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸異丙酯、甲苯(DMF，色譜純，德國(guó)默克公司);純水由Milli-Q 水純化系統(tǒng)(實(shí)驗(yàn)值自制)制備.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:DB-624 毛細(xì)管柱(60 m×0.53 mm，3.0 μm);載氣及流速:氮?dú)?純度＞99.999%)，3.3psi(恒壓);進(jìn)樣口溫度:200 ℃;分流比:10∶1;檢測(cè)器溫度:250 ℃;進(jìn)樣量:1 mL;色譜柱升溫程序:42 ℃保持15 min，以10 ℃/min 升至60 ℃，保持4 min，再以10 ℃/min 升至175 ℃，保持5 min，最后以25 ℃/min 升至220 ℃，保持5 min.

1.2.2 對(duì)照溶液的配制 對(duì)照儲(chǔ)備液1:取600 mg 二氯甲烷、410 mg 乙腈、290 mg 正己烷、890 mg 甲苯，精密稱定，至50 mL 容量瓶中，用DMF 定容至刻度;

對(duì)照儲(chǔ)備液2:取300 mg 甲醇、500 mg 丙酮、500 mg 異丙醇、500 mg 乙酸異丙酯，精密稱定至50 mL 容量瓶中，再精密移取5.0 mL 對(duì)照儲(chǔ)備液1 至上述50 mL 容量瓶中，用DMF 定容至刻度;

對(duì)照液:精密移取5.0 mL 對(duì)照儲(chǔ)備液2 至100 mL 容量瓶中，用DMF 定容至刻度，再精密移取5 mL 上述溶液和2 mL 超純水至20 mL 頂空瓶中，密封搖勻，即得.

1.2.3 供試液的配制 取500 mg 供試品，精密稱定至20 mL 頂空瓶中，精密移取5.0 mL DMF 和2 mL 超純水至上述頂空瓶中，密封搖勻，即得.

1.2.4 供試品加標(biāo)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取500 mg 供試品，精密稱定至20 mL 頂空瓶中，精密移取5.0 mL對(duì)照液和2 mL 超純水至上述頂空瓶中，密封搖勻，即得.

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的建立與優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化 比較了DB-1(30 m×0.53 mm，3.0 μm)，DB-1701(30 m×0.53 mm，3.0 μm)，DB-Wax(30 m×0.53 mm，3.0 μm)，DB-624(30 m×0.32 mm，3.0 μm)，DB-624(30 m×0.53 mm，3.0 μm)，DB-624(60 m×0.53 mm，3.0 μm)對(duì)8 種待測(cè)殘留溶劑的分離效果.結(jié)果表明，DB-1 毛細(xì)管柱不能有效分離丙酮與異丙醇;B-1701 毛細(xì)管柱不能有效分離丙酮、二氯甲烷與異丙醇;DB-Wax 毛細(xì)管柱不能有效分離二氯甲烷與異丙醇;DB-624(30 m×0.32 mm，3.0 μm)毛細(xì)管柱中乙腈與二氯甲烷的分離度也只有1.0;改用粗口徑的DB-624 柱(30 m×0.53 mm，3.0 μm)，乙腈與二氯甲烷的分離度能達(dá)1.5;繼續(xù)提高柱長(zhǎng)以提高柱效，使用DB-624(60 m×0.53 mm，3.0 μm)乙腈與二氯甲烷能完全基線分離(＞3.0)，且其他各溶劑峰形與分離度都良好.因此，本研究最終選用DB-624(60 m×0.53 mm，3.0 μm)毛細(xì)管柱分離8 種待測(cè)的溶劑，典型色譜圖見(jiàn)圖1.

圖1 空白液(A)、對(duì)照液(B)、供試品加標(biāo)液(C)的色譜圖:1.甲醇，2.丙酮，3.異丙醇，4.乙腈，5.二氯甲烷，6.正己烷，7.乙酸異丙酯，8.甲苯，9.N，N-二甲基甲酰胺(DMF，溶劑)Fig.1 Chromatograms of blank solution(A)，reference solution(B)，and spiked sample solution(C):1.methanol，2.acetone，3.isopropanol，4.acetonitrile，5.dichloromethane，6.n-hexane，7.isopropyl acetate，8.toluene，9.DMF(solvent)

2.1.2 溶劑的選擇 根據(jù)樣品的溶解性考察幾種適用于頂空氣相的溶劑:DMF、DMI、DMSO.DMI 與DMSO在所選用的頂空條件下均出現(xiàn)未知峰并干擾測(cè)定，原因可能是相應(yīng)溶劑在高溫條件下與樣品基質(zhì)發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生雜質(zhì).DMF 作為溶劑未出現(xiàn)未知峰，但在回收率考察的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)甲醇、異丙醇靈敏度低，且回收率很低(甲醇僅為10%，異丙醇僅為40%)，原因應(yīng)為甲醇與異丙醇極性較大，在DMF 中難以揮發(fā)，氣液分配系數(shù)小，且易受樣品基質(zhì)的影響.考察發(fā)現(xiàn)考慮往DMF 樣品溶劑中加水，可以有效增強(qiáng)甲醇與異丙醇的靈敏度，同時(shí)也能降低甲醇與異丙醇的基質(zhì)效應(yīng)，提高回收率.本研究最終選用5 mL DMF 樣品溶液加2 mL 超純水作為頂空溶液，甲醇和異丙醇的響應(yīng)與回收率均顯著增加(甲醇95.0%～98.9%，異丙醇99.5%～101.8%)，其他溶劑的響應(yīng)也都有提高且回收率均滿足要求.

加水即可以增強(qiáng)靈敏度又能提高回收率的原因應(yīng)該為加入一定量的水后提高頂空溶液的極性，增大甲醇、異丙醇等與頂空溶劑的極性差別，從而使甲醇和異丙醇更易從頂空溶劑中釋放出來(lái)，即增加甲醇和異丙醇的響應(yīng)強(qiáng)度，也使甲醇和異丙醇受基質(zhì)影響的程度也變小，提高了回收率.該機(jī)理應(yīng)該與文獻(xiàn)中加鹽能誘導(dǎo)均相溶液分相的機(jī)理一致［14］，即加入一極性差別大的溶劑能改變?cè)芤褐薪M分的分配性能.

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 系統(tǒng)適用性 取對(duì)照溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，甲醇、丙酮、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸異丙酯和甲苯的峰面積的RSD 見(jiàn)表1.

表1 8 種殘留溶劑的系統(tǒng)適用性Tab.1 System suitability of the determination of eight solvents

2.2.2 專屬性 取對(duì)照品溶液、供試品加標(biāo)溶液、空白稀釋液，分別進(jìn)樣分析.對(duì)照品溶液、供試品加標(biāo)溶液中各測(cè)定溶劑的與鄰近峰的分離度均大于2.0;供試品加標(biāo)溶液與對(duì)照品溶液中各待測(cè)溶劑保留時(shí)間一致;空白稀釋液中在各待測(cè)溶劑出峰處均無(wú)干擾.專屬性實(shí)驗(yàn)證明該方法專屬性良好.

2.2.3 方法精密度 平行配制6 份供試品加標(biāo)溶液，分別進(jìn)樣分析，計(jì)算8 種殘留溶劑含量的RSD，結(jié)果見(jiàn)表2.各測(cè)定溶劑的RSD 小于3%，表明方法精密度良好.

表2 8 種殘留溶劑的精密度Tab.2 Precision of the determination of eight solvents

2.2.4 線性范圍 配制不同濃度水平的對(duì)照溶液(各溶劑ICH 限度的20%至150%)，分別進(jìn)樣分析，計(jì)算各測(cè)定溶劑的線性回歸方程，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表3所示.各測(cè)定溶劑線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明線性良好.

表3 8 種殘留溶劑的線性Tab.3 Linearity of the determination of eight solvents

2.2.5 準(zhǔn)確度 配制高(150%)、中(100%)、低(20%)3 個(gè)濃度水平的供試品加標(biāo)溶液，各濃度水平配制3份，分別進(jìn)樣分析.8 種待測(cè)殘留溶劑的回收率和RSD 值見(jiàn)表4.結(jié)果表明，各溶劑的各加標(biāo)水平回收率均在90%～110%范圍內(nèi)，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度良好.

表4 8 種殘留溶劑的回收率Tab.4 Recovery of the determination of eight solvents

2.3 實(shí)際樣品的分析

對(duì)自研的3 批硫酸氫氯吡格雷樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只檢出甲醇、異丙醇和乙酸異丙酯(表5)，其他溶劑均未被檢出.

表5 自制樣品中8 種殘留溶劑的檢測(cè)結(jié)果Tab.5 Determination results of the eight solvents in actual samples

3 結(jié)論

本研究采用DB-624 毛細(xì)管柱(60 m×0.53 mm，3.0 μm)，通過(guò)常規(guī)的靜態(tài)頂空的分析方法，就可以同時(shí)分離分析硫酸氫氯吡格雷原料藥中8 種潛在的殘留溶劑.本方法具有良好的專屬性、線性、準(zhǔn)確度，為更好的控制硫酸氫氯吡格雷產(chǎn)品的質(zhì)量奠定了基礎(chǔ).

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