兔眼藍(lán)莓組織培育苗高效快繁技術(shù)

邱義蘭，陳冰心，鄧喜艷，黃雄軍，吳 婷，劉如石*

(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國長沙 410081;2.長沙智博生物科技有限公司，中國長沙 410200)

藍(lán)莓屬杜鵑花科越橘屬(Vaccinum)植物中的藍(lán)果類型，為多年生落葉或者常綠小果類灌木型果樹.藍(lán)莓果實(shí)富含花青素、不飽和脂肪酸、鞣酸及鈣、鉀、鋅、鐵等元素，B 族維生素在藍(lán)莓果中含量尤為突出.藍(lán)莓具有很高的保健功能，被國際糧農(nóng)組織列為五大健康食品之一，堪稱世界水果之王，是近幾年來發(fā)展最迅速的集營養(yǎng)與保健于一身的第3 代果樹品種［1-4］.

兔眼藍(lán)莓(Vaccinium ashei Reade)是越桔屬中經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的一種，品質(zhì)佳，口感好，其生態(tài)適應(yīng)性、長勢和抗病蟲性較強(qiáng)，無論高地還是低地、粘土或沙土上均能生長，非常適合我國南方栽培.隨著引種規(guī)模日益擴(kuò)大，優(yōu)良種苗需求量急劇增加，種苗生產(chǎn)供不應(yīng)求.組織培養(yǎng)憑借其無性繁殖的獨(dú)特優(yōu)勢，可以迅速去除病毒和更新品種，保留品種的本來特性，變異性小，并且可在較小空間和較短時(shí)間內(nèi)快速地獲得大量無性系組培苗，成為藍(lán)莓脫毒和快速繁殖的主要途徑.作者就兔眼藍(lán)莓建立了一種高速快繁的有效方法.

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為智博生物科技公司種植園種植的兔眼藍(lán)莓品種——杰兔.外植體材料為當(dāng)年生幼嫩枝.

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得 以田間生長的當(dāng)年生嫩枝為初始外植體，摘除葉片.用洗衣粉水溶液洗凈灰塵等污物后，自來水沖洗.轉(zhuǎn)到超凈工作臺上，先后用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇和1 g/L 氯化汞對外植體分別進(jìn)行50 s 與10 min 的表面滅菌，接著用無菌水沖洗4 次(每次約2 min)，最后用無菌濾紙吸去外植體表面水分.將枝條切成1～2 cm 長的單芽莖段，在無菌條件下將單芽莖段接種于WPM(改良)+1.0 mg/L ZT+20 g/L 蔗糖+9 g/L日產(chǎn)瓊脂粉的培養(yǎng)基(pH=5.2)上誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)(圖1A).培養(yǎng)條件為:溫度(25 ±2)℃、光強(qiáng)2 500 Lx、光周期16 h 光照/8 h 黑暗.30 d 后莖段腋芽伸長約4～6 cm，葉片數(shù)量達(dá)7～9 枚(圖1B).WPM 培養(yǎng)基具體改良方法:以Ca(NO3)2·4H2O、KNO3代替原WPM 培養(yǎng)基中的CaCl2、K2SO4.

1.2.2 叢生芽的誘導(dǎo)與增殖 待莖段葉芽伸長后，切下轉(zhuǎn)接于以改良WPM 為基本培養(yǎng)基，加蔗糖20 g/L，日產(chǎn)瓊脂粉8.8 g/L，附加不同濃度的ZT 和(或)6-BA 的增殖培養(yǎng)基(pH=5.2)中，具體是:0.5 mg/L ZT，1.0 mg/L ZT，2.0 mg/L ZT，5.0 mg/L ZT，0.5 mg/L 6-BA，1.0 mg/L 6-BA，0.5 mg/L6-BA+1.0 mg/L ZT，1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ZT.培養(yǎng)條件同上.

圖1 A:單芽莖段誘導(dǎo)側(cè)芽的萌發(fā);B:培養(yǎng)30 d 后伸長的莖段腋芽;C:葉片葉尖端先暗培養(yǎng)20 d 后光照培養(yǎng)10 d 形成的重生苗(箭頭所示);D:葉片葉柄端先暗培養(yǎng)20 d 后光照培養(yǎng)10 d 形成的重生苗(箭頭所示);E:葉片離體培養(yǎng)50 d 后形成的重生苗Fig.1 A:Germination of the stems with single axillary bud;B:Elongated axillary buds of the stems cultured for 30 d;C:Regeneration plantlets from the tip part of the blades cultured first for 20 d in the dark and then for 10 d in the 15 h lighting and 9 h darkness(arrow);D:Regeneration plantlets from the petiole part of the blades cultured first for 20 d in the dark and then for 10 d in the 15 h lighting and 9 h darkness(arrow);E:Regeneration plantlets from the blades in vitro cultured for 50 d

1.2.3 葉片再生體系的建立 以改良WPM+1.0 mg/L ZT+20 g/L 蔗糖+9 g/L 瓊脂粉(pH=5.2)為培養(yǎng)基，取無菌苗植株上碧綠的葉片，按不同的葉片切法、不同培養(yǎng)方式、不同濃度的ZT，篩選最合適的葉片再生體系.4 種不同的葉片切法:垂直葉片主脈切取葉片的1/2、1/3、2/3 以及全葉，背面朝下，葉尖與葉柄分開放置，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶10 片左右，每個(gè)處理組重復(fù)8～10 瓶.不同培養(yǎng)方式:暗培養(yǎng)時(shí)間分別為0、7、20、30 d，每個(gè)處理重復(fù)15～20 瓶(暗培養(yǎng)溫度為(25 ±2)℃).幾種濃度ZT(mg/L):0.5、0.8、1.1、1.4、1.7、2.0.30 d 后觀察記錄葉片的出芽率與生長狀況，計(jì)算誘導(dǎo)重生苗率=誘導(dǎo)重生苗形成的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)，從而獲得最佳的葉片再生體系.培養(yǎng)條件同上.

1.2.4 試管苗生根培養(yǎng) 剪取苗高約2.0 cm 左右的單芽莖段，改良WPM 為基本培養(yǎng)基，另添加蔗糖20 g/L，瓊脂9 g/L，pH 值5.3 左右.從不同鹽濃度(WPM、1/2WPM、1/4 WPM、1/8 WPM)、不同活性炭質(zhì)量濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L)、不同IBA 質(zhì)量濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L)的培養(yǎng)基中篩選出最適宜的生根培養(yǎng)基.培養(yǎng)條件同上.

1.2.5 煉苗 煉苗時(shí)，提前3 d 打開瓶蓋進(jìn)行過渡.移栽后在組培室條件下保持濕度100%的塑料棚中培養(yǎng)20 d，然后在濕度80%、透光度70%的室外條件下過渡7 d 再逐步通風(fēng)換氣.15 d 后，完全揭去棚膜.2 周后統(tǒng)計(jì)成活率.煉苗時(shí)，每套基質(zhì)的栽植量不少于50 株.各試驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)不少于3 次.幾種煉苗基質(zhì)為:V(草炭)∶V(河沙)=1∶1;V(草炭)∶V(田土)=1∶1;V(草炭)∶V(石英砂)=2～3∶1;V(草炭)∶V(珍珠巖)=1～2∶1;全部采用水苔蘚.

2 結(jié)果與分析

2.1 叢生芽的誘導(dǎo)與增殖

將獲得的無菌苗轉(zhuǎn)接到幾種增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行比較.圖2 的結(jié)果表明，改良WPM+ZT 的增殖效果明顯優(yōu)于改良WPM+6-BA 和改良WPM+6-BA+ZT 的組合.在WPM+ZT 中，不定芽的發(fā)生率與培養(yǎng)基中的ZT有密切的關(guān)系.當(dāng)ZT 質(zhì)量濃度為1 mg/L 時(shí)，10 d 左右在苗莖基部開始出現(xiàn)叢生芽，20 d 后增殖率超過6倍，經(jīng)幾次繼代后，增殖率高達(dá)40～50 倍，叢生芽粗壯，生長勢頭好，呈鮮嫩狀.當(dāng)ZT 質(zhì)量濃度升高到2 mg/L時(shí)，叢生芽開始生長和分化的時(shí)間與1 mg/L 時(shí)相差不大，其增殖率稍有增加.當(dāng)ZT 質(zhì)量濃度高于2 mg/L 時(shí)，再生苗開始生長和分化現(xiàn)象提前，多數(shù)分化出來的新梢枝上出現(xiàn)2 次枝，增殖率超過12 倍，苗長勢較弱且同時(shí)出現(xiàn)玻璃化苗現(xiàn)象.WPM 與其他激素組合效果均差于WPM+ZT 組合.使用6-BA 時(shí)，0.5 mg/L 和1 mg/L 兩種質(zhì)量濃度差異不大，叢生芽均會在兩周后出現(xiàn)生長和萌芽態(tài)勢，增殖率為4～5 倍，其叢生芽生長緩慢，葉小且發(fā)紅.而對于6-BA+ZT 組合，10 d 后出現(xiàn)少量愈傷，增殖率為6～8 倍，叢生芽生長速度慢.因此，從增殖率、叢生芽長勢、玉米素成本等方面進(jìn)行綜合考慮，繼代培養(yǎng)基以改良WPM+1 mg/L ZT 為最佳.

圖2 不同增殖培養(yǎng)基上莖段的增殖率Fig.2 Reproductive rate of stems in different reproduction culture medium

2.2 葉片再生體系的建立

2.2.1 葉片不同部位對重生苗誘導(dǎo)的影響 離葉尖1/3、1/2、2/3 和全葉，按垂直葉片主脈方向?qū)⑷~片切成二部分，葉片背面朝下接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，30 d 后統(tǒng)計(jì)葉片重生率，結(jié)果見表1.從表1 中可以看出，離葉尖1/3處切法的誘導(dǎo)重生苗率最高，達(dá)到50%以上，而全葉的誘導(dǎo)重生苗率最低，僅26.1%.在幾種葉片切法中，葉尖端的重生苗誘導(dǎo)率比葉柄端高(圖1C，D，E).在同一植物體甚至相同器官組織中的不同細(xì)胞，其內(nèi)源植物生長激素水平以及對外源植物生長調(diào)節(jié)劑的親和力或敏感度存在差異［5］.作者在研究中發(fā)現(xiàn)完整葉片培養(yǎng)過程中形成的愈傷組織很少，葉片被切割后在切口處形成的愈傷組織較多(該結(jié)果在本文中未顯示)，從而推測，前者對玉米素敏感度可能低于后者，葉片被切割后葉尖端對玉米素的敏感度可能高于葉柄端，因此全葉的誘導(dǎo)重生苗率最低，葉尖端的重生苗誘導(dǎo)率比葉柄端高.

表1 葉片不同部位對重生苗誘導(dǎo)的影響Tab.1 Effects of different blade position on induction of regeneration seedlings

2.2.2 不同暗培養(yǎng)時(shí)間對葉片重生苗誘導(dǎo)的影響 在建立植物再生體系的研究中，暗培養(yǎng)是某些植物外植體重生苗的重要影響因素.不同暗培養(yǎng)時(shí)間對葉片重生苗誘導(dǎo)的影響見表2.從表2 可以看出，隨著暗培養(yǎng)時(shí)間的延長，重生苗誘導(dǎo)頻率呈增高趨勢，不經(jīng)暗培養(yǎng)直接在光照條件下的葉片重生率僅為29.3%，暗培養(yǎng)20 d 后的葉片重生率高達(dá)93.2%.當(dāng)暗培養(yǎng)時(shí)間超過30 d 后，雖然葉片重生率超過90%，但由于葉片重生苗在暗培養(yǎng)時(shí)形成白化畸形苗，其有效苗數(shù)反而減少.由此可見20 d 的暗培養(yǎng)時(shí)間最為適宜.

表2 不同暗培養(yǎng)時(shí)間對葉片重生苗誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effects of different time of dark culture on induction of regeneration seedlings of the blade

2.2.3 ZT 濃度對誘導(dǎo)葉片重生苗的影響 ZT 是一種高活力的細(xì)胞分裂素，具有打破植株頂端優(yōu)勢、促進(jìn)腋芽萌發(fā)、誘導(dǎo)不定芽形成的作用.將離葉尖1/3 處按垂直葉片主脈方向?qū)⑷~片切成葉尖端和葉柄端2 部分，研究不同濃度的ZT 對葉片重生苗的誘導(dǎo)作用，結(jié)果見表3.從表3 可以看出，0.5～2.0 mg/L ZT 均能誘導(dǎo)葉片不經(jīng)愈傷組織直接出芽，植株的變異性減少.不同濃度的ZT 對葉片重生苗誘導(dǎo)的效果存在明顯差異.0.5 mg/L ZT 對葉片重生苗的誘導(dǎo)率低，尚不足50%，葉片的葉尖端主要誘導(dǎo)簇生苗，葉柄端主要誘導(dǎo)單生苗;隨著ZT 濃度的升高，葉片重生苗的誘導(dǎo)率增加，在1.7 mg/L ZT 時(shí)達(dá)到最高，葉片的葉尖端與葉柄端的重生苗誘導(dǎo)率分別達(dá)到93.8%和79.5%，且主要為簇生苗，在2.0 mg/L ZT 時(shí)均有所下降.因此，誘導(dǎo)葉片形成重生苗的最佳ZT 質(zhì)量濃度為1.7 mg/L.

表3 不同質(zhì)量濃度ZT 對誘導(dǎo)葉片重生苗的影響Tab.3 Effects of different mass concentration of ZT on induction of regeneration seedlings of the blade

2.3 試管苗的瓶內(nèi)生根

2.3.1 鹽濃度對生根的影響 單個(gè)芽苗在不同鹽濃度的生根培養(yǎng)基中的生根誘導(dǎo)率存在差異.從表4 可以看出，高鹽濃度不利于芽苗生根，大量元素不減少時(shí)僅在莖切段形成愈傷組織;大量元素減半時(shí)，在20 d 左右開始生根，生根率達(dá)40%;大量元素減少到原來的1/4 時(shí)，開始生根的時(shí)間為10 d 左右，生根率提高到90%以上，苗長勢強(qiáng)，葉色綠;而大量元素減少到原來的1/8 時(shí)，第8 天左右就開始生根，生根率也達(dá)到了90%以上，由于營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，苗長勢弱，葉色黃且無光澤.因此適當(dāng)降低鹽濃度有利于生根且不影響苗的生長.

表4 不同鹽濃度對生根的影響Tab.4 Effects of different salinity on rooting

2.3.2 活性碳和生長素對生根的影響 活性碳對組培苗瓶內(nèi)生根具有重要影響.由表5 可看出，當(dāng)培養(yǎng)基中無活性碳時(shí)，插入培養(yǎng)基中的莖基部均先長愈傷組織然后生根，由于莖根之間維管束不通，不久莖即停止生長，葉色發(fā)紅脫落，苗長勢差.活性炭對杰兔生根具有促進(jìn)作用，但是存在不同的濃度效應(yīng):效果最好的是1.0 g/L 活性碳，在0.1～0.8 mg/L IBA 的有效生根率均達(dá)到80%以上，特別是在0.1 mg/L IBA 時(shí)生根率達(dá)到了90%以上，莖基部產(chǎn)生愈傷組織較少或不產(chǎn)生愈傷組織，莖生長正常，10 d 左右可見莖基部有根形成，45 d 左右長出4～6 條根，根長達(dá)6 cm 左右;效果其次的是1.5 g/L 活性碳，在0.1 mg/L IBA 時(shí)其有效生根率也達(dá)到了80%以上;當(dāng)培養(yǎng)基中的活性碳為2.0 g/L 時(shí)，有效生根率明顯降低，有效根數(shù)和根長也減少.

表5 活性碳及IBA 濃度對組培苗瓶內(nèi)生根的影響Tab.5 Effects of different concentration of active carbon and IBA on rooting in the culture bottle

另外，IBA 濃度對杰兔生根具有明顯作用，表5 的結(jié)果表明，低濃度的IBA 更有利于杰兔生根，在活性碳質(zhì)量濃度為0.5～2.0 g/L 的培養(yǎng)基中，0.1 mg/L IBA 的有效生根率均達(dá)到70%以上，隨著IBA 濃度的升高，有效生根率降低.

綜合以上結(jié)果，杰兔瓶內(nèi)生根培養(yǎng)基中最佳的活性炭和IBA 質(zhì)量濃度分別為1.0 g/L 和0.1 mg/L，有效生根率高達(dá)95%.

2.4 煉苗基質(zhì)的優(yōu)化

剪取2 cm 左右長的無菌苗新梢在生根培養(yǎng)基中生長，約45 d 左右苗高長至5～6 cm 時(shí)，生根率達(dá)95%.對生根苗移栽在5 種不同基質(zhì)上，1.5 個(gè)月后統(tǒng)計(jì)成活率.從圖3可看出，水苔蘚的效果最好，成活率高達(dá)100%，苗木的生長量達(dá)3cm 以上，新增葉片6～8 枚.效果其次的是體積比為2～3∶1 的草炭與石英砂組合，其成活率為86%，苗木的生長量較高.體積比為1∶1 的草炭與河沙基質(zhì)的成活率僅為52%，但成活苗的質(zhì)量卻很高，表現(xiàn)為生長墩實(shí)、植株健壯、生長量與“草炭+石英砂”相當(dāng).草炭+園土基質(zhì)與草炭+珍珠巖基質(zhì)的效果居中.

圖3 不同煉苗基質(zhì)對試管苗成活率的影響Fig.3 Effects of different refine seedling substrates on survival ratio of tissue culture seedling

3 討論

已有研究表明，藍(lán)莓快繁的培養(yǎng)基以改良WPM 的效果最好［6］，且在芽的誘導(dǎo)和增殖中細(xì)胞分裂素的作用至關(guān)重要［7-8］.玉米素是一種高活力的細(xì)胞分裂素，因此，作者主要采用了改良WPM 培養(yǎng)基，重點(diǎn)探討了玉米素的效應(yīng).本研究表明，利用1 mg/L ZT進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖倍數(shù)達(dá)到6 倍以上，且叢生芽生長健壯，生長速度快;2 mg/L ZT 的增殖倍數(shù)稍高于1 mg/L ZT;5 mg/L ZT 的增殖倍數(shù)高達(dá)12 倍，然而玻璃化現(xiàn)象的出現(xiàn)使有效苗數(shù)減少.由于ZT 價(jià)格貴，結(jié)合生產(chǎn)成本考慮，1 mg/L ZT 的增殖效率最佳，通過幾次繼代，其增殖倍數(shù)可達(dá)30～40 倍.

葉片離體再生體系的建立具有以下兩個(gè)方面的優(yōu)勢，一方面由于葉片數(shù)量多和采集時(shí)對母體傷害小，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的無菌苗;另一方面它又是利用生物工程技術(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因進(jìn)行品種創(chuàng)新的基礎(chǔ).到目前為止，國內(nèi)外關(guān)于藍(lán)莓葉片再生的研究主要集中于高叢、矮叢多個(gè)品種［8-10］，有關(guān)兔眼藍(lán)莓葉片再生的研究未見報(bào)道.本研究以杰兔無菌苗葉片為材料，建立了兔眼藍(lán)莓高效的葉片再生體系.按垂直葉片主脈方向離葉尖1/3 處將葉片切成二部分，同時(shí)接種于改良WPM+1.7 mg/L ZT 的培養(yǎng)基中，先暗培養(yǎng)20 d 后光照培養(yǎng)，葉片的葉尖端和葉柄端均能不經(jīng)愈傷組織形成再生苗，保持了再生苗的優(yōu)良特性.將葉尖端和葉柄端的再生率合起來，葉片再生率高達(dá)173.3%.由于組培苗葉片的數(shù)量多和高的葉片再生率，再結(jié)合莖的增殖培養(yǎng)，其增殖倍數(shù)非常可觀，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前人在兔眼藍(lán)莓增殖研究中的結(jié)果［11-16］.

組織培養(yǎng)過程中，試管苗的生根好壞將直接影響到試管苗的質(zhì)量和移栽成活率.隨著藍(lán)莓組織培養(yǎng)技術(shù)的越來越成熟，許多藍(lán)莓品種試管苗瓶內(nèi)生根已成為可能，但是存在品種差異［15-16］.本研究采用1/4WPM(改良)+1.0 g/L 活性碳+0.1 mg/L IBA 配方，能使新梢在10 d 左右開始生根，生根率高達(dá)95%，苗健壯且生長速度快，大約45 d 就可出瓶煉苗，該結(jié)果優(yōu)于以往的研究［17］.在煉苗方面，國內(nèi)報(bào)道的多種配方均以考慮如何為藍(lán)莓生長提供適宜的pH 值，他們以草炭土或其類似物為基本介質(zhì)，再附加支撐材料調(diào)節(jié)基質(zhì)的通透性［13，17-19］.藍(lán)莓組培苗小而弱，根纖細(xì)，移栽較其它植物組培苗困難.移栽成活的關(guān)鍵是小環(huán)境保濕和基質(zhì)通氣性好，以保證小植株不失水并有利于根的再生長.本研究采用塑料小拱棚保濕和水苔蘚為煉苗基質(zhì)，由于水苔蘚的通透性非常好，其pH 為5.0 左右且富含有機(jī)質(zhì)，幼苗成活率高達(dá)100%，幼苗生長快且健壯，煉苗效果明顯優(yōu)于國內(nèi)已報(bào)道的以草炭土為基本介質(zhì)的煉苗基質(zhì).因此，本研究從葉片再生、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)到煉苗這幾個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了一系列的優(yōu)化，建立了一套可高效、快速、持續(xù)獲得優(yōu)良的兔眼組培種苗的技術(shù)體系，有助于我國藍(lán)莓栽培產(chǎn)業(yè)化發(fā)展.

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