Bub1和Mad2蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義

莊雪儀，李 玲，李愛香

2.河南省人口與計劃生育科學(xué)研究院 生殖科，鄭州450052

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢。苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白－1（Bub1）和有絲分裂阻滯缺陷蛋白－2（Mad2）蛋白是紡錘體關(guān)卡的重要組成部分，其功能是監(jiān)控細(xì)胞有絲分裂，保證其過程忠實有序的進(jìn)行。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測Bub1和Mad2蛋白在人正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況，并分析其與子宮內(nèi)膜癌患者的臨床分期、病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，探討其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2009年6月－2012年6月確診為子宮內(nèi)膜癌的手術(shù)切除存檔蠟塊標(biāo)本72例，為子宮內(nèi)膜癌組（A組），年齡（50.37±4.54）歲（42～57歲），其中絕經(jīng)患者58例。病理類型：內(nèi)膜樣腺癌46例，腺癌伴鱗狀上皮化生16例，漿液性腺癌9例，透明細(xì)胞癌1例；臨床分期：Ⅰ期43例，Ⅱ期19例，Ⅲ期7例，Ⅳ期3例；病理分級：G1（高分化）43例，G2（中分化）20例，G3（低分化）9例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例。選取同期子宮內(nèi)膜不典型增生石蠟包埋組織標(biāo)本40例，為不典型增生組（B組），年齡（47.87±5.32）歲；正常子宮內(nèi)膜石蠟包埋組織標(biāo)本40例，為正常子宮內(nèi)膜組（C組），年齡（48.63±3.80）歲。3組間年齡差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。所有患者術(shù)前均未接受激素治療、放療或化療。

1.2 方法

1.2.1 試劑 一抗兔抗人多克隆抗體Bub1和Mad2（工作濃度為1∶100，美國Abcom公司）；SP試劑盒和DAB顯色劑（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2 檢測方法及判斷標(biāo)準(zhǔn) 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測各組中Bub1和Mad2蛋白的表達(dá)情況，子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)和／或胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。判定標(biāo)準(zhǔn)：采用半定量、2人雙盲法觀察結(jié)果，每例切片選擇10個高倍視野（10×40），按照陽性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)的百分比分為4級：無陽性著色或陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為（－），11% ～30% 為 （＋），31% ～50% 為 （），≥51%為（）；（－）為陰性表達(dá)，（＋）～（）為陽性表達(dá)[1]。若2人觀察結(jié)果相差10%則重新評定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理。定性資料比較采用χ2檢驗，Bub1和Mad2蛋白的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析，α＝0.05設(shè)為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 Bub1和 Mad2蛋白檢測結(jié)果 A，B，C組Bub1蛋白的陽性表達(dá)率分別為27.78%，57.50%，85.00%；Mad2蛋白的陽性表達(dá)率分別為86.11%，57.50%，22.50%；2種蛋白3組間兩兩比較差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 Bub1及Mad2蛋白的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Bub1蛋白在臨床分期為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ期的患者中的陽性表達(dá)率比較差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而 Mad2蛋白則無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；2種蛋白在病理分級為 G1，G2，G3的患者中陽性表達(dá)率差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者中，Bub1蛋白的陽性表達(dá)率分別為0%及31.75%，Mad2蛋白的陽性表達(dá)率分別為88.89%及85.71%，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1，表1）。

圖1 子宮內(nèi)膜癌組織中Bub1及Mad2蛋白的表達(dá)（DAB染色 ×400）Fig 1 Immunohistochemical figure of Bud1and Mad2（DAB ×400）

表1 Bub1及Mad2蛋白的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)關(guān)系Tab 1 Parameter relationship between positive expression rate of Bub1and Mad2and clinical stage，pathology classification and lymph node etastasis

2.3 Bub1和Mad2蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的相關(guān)性分析 2種蛋白在子宮內(nèi)膜癌組中均為陽性表達(dá)的有13例，均為陰性的有3例。根據(jù)其陽性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)的百分比，二者在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01，表2）。

表2 子宮內(nèi)膜癌組織中Bub1和Mad2的相關(guān)性Tab 2 The correlation of Bub1and Mad2

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病年齡逐漸年輕化且發(fā)病率呈顯著上升趨勢。近年來的研究表明，細(xì)胞周期調(diào)控紊亂與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[2]。Bub1和Mad2蛋白是紡錘體關(guān)卡的重要組成部分，在細(xì)胞有絲分裂過程中監(jiān)控紡錘體形態(tài)、染色體著絲點與微管聯(lián)接以及染色體位置和排列，如果其表達(dá)和／或功能異常時，紡錘體關(guān)卡就會忽略染色體損傷，繼續(xù)有絲分裂周期，染色體分配過程就有可能發(fā)生錯誤，造成染色體的不穩(wěn)定性[1]。

本研究結(jié)果表明，Bub1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，其在子宮內(nèi)膜癌患者中的陽性表達(dá)率明顯低于正常子宮內(nèi)膜，且內(nèi)膜癌的分化程度越低、臨床分期越晚，陽性表達(dá)率越低，但與是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，提示Bub1蛋白表達(dá)可能與內(nèi)膜癌預(yù)后相關(guān)。Bub1基因發(fā)生突變的機(jī)率極低，Bub1蛋白在內(nèi)膜癌組織中表達(dá)降低，可能由于癌組織中Bub1的上游基因發(fā)生突變而導(dǎo)致Bub1表達(dá)降低，Bub1表達(dá)缺乏會導(dǎo)致P53介導(dǎo)的受損細(xì)胞早期凋亡通路中紡錘體關(guān)卡功能受損，導(dǎo)致非整倍體染色體的形成和積累[3]。有研究表明，內(nèi)膜癌組織中非整倍體染色體細(xì)胞率明顯高于不典型增生和正常子宮內(nèi)膜組織，非整倍體可以獨立于基因突變而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[4－5]。

本研究也顯示，Mad2蛋白在子宮內(nèi)膜癌患者中的陽性表達(dá)率明顯高于正常子宮內(nèi)膜，且子宮內(nèi)膜癌的分化程度越低，陽性表達(dá)率越高，但與臨床分期和是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。Mad2蛋白同樣以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主，在細(xì)胞有絲分裂過程中可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白，使細(xì)胞進(jìn)行染色體的分離[6]。Mad2基因也極少發(fā)生突變，可能是由于某種或多種因素導(dǎo)致Mad2蛋白在內(nèi)膜癌中表達(dá)增高，繼而使紡錘體檢測點功能受損，引起紡錘體檢查點控制失常，導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性增加，染色體缺失的機(jī)率升高[7]。Sotillo等研究表明，Mad2過表達(dá)可以刺激小鼠體內(nèi)不同亞型腫瘤的啟動和進(jìn)展[8]。

本研究結(jié)果還表明，Bub1和Mad2蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Bub1是Bub家族的成員之一，基因定位于2q14，其表達(dá)產(chǎn)物是紡錘體關(guān)卡的必要組分。Bub1蛋白是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，在各種生物中，Bub1是招募 Mad1、Mad2、蛋白瞵酸酶（PP）等到動點所必須的。Bubl蛋白表達(dá)異常會使紡錘體關(guān)卡功能受損，導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂過程中染色體分配錯誤，造成非整倍體和染色體不穩(wěn)定性（Chromosomeinstability，CIN）的產(chǎn)生[9]。Mad2是Mad家族的成員之一，其基因定位于4q27，Mad2蛋白是紡錘體關(guān)卡的必要組成部分，其位于游離染色體著絲點上，參與監(jiān)控著絲點與紡錘體微管的聯(lián)接，并發(fā)出聯(lián)結(jié)缺損信號。在信號級聯(lián)中，Bub1位于信號級聯(lián)的上游，為Mad2檢測張力動粒所必須。當(dāng)染色體受到損傷，紡錘體關(guān)卡被激活，Mad2通過抑制后期促進(jìn)復(fù)合體的活性，阻止細(xì)胞向后期轉(zhuǎn)變[10]。Bub1表達(dá)降低，使Mad2定位動粒的能力降低，忽略染色體的異常，加快有絲分裂的進(jìn)程[11]。Bub1和 Mad2蛋白均表達(dá)異常，可能會加重染色體不穩(wěn)定的發(fā)生，具有染色體不穩(wěn)定性質(zhì)的細(xì)胞易于發(fā)生染色體畸變，最終可能會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，Bubl和Mad2蛋白表達(dá)異常會造成染色體不穩(wěn)定和非整倍體細(xì)胞，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，二者相互作用，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程起重要作用。因此聯(lián)合檢測兩個指標(biāo)較單一檢測其中某一個指標(biāo)更具有臨床意義。

[1]Ito D，Saito Y，Matsumoto T.Centromere－tethered Mps1 pombe homolog（Mph1）kinase is a sufficient marker for recruitment of the spindle checkpoint protein Bub1，but not Mad1[J].ProcNatlAcadSciUSA，2012，109（1）：209－214.

[2]李志琴，章靜波.細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤[J].癌癥進(jìn)展雜志，2004，2（2）：146－150.

[3]Gao F，Ponte J F，Papageorgis P，etal.hBub1deficiency triggers a novel p53mediated early apoptotic checkpoint pathway in mitotic spindle damaged cells[J].CancerBiolTher，2009，8（7）：627－635.

[4]馬 哲，劉 力.子宮內(nèi)膜癌DNA倍體、SPF的檢測及其臨床意義的研究[J].中國婦幼保健，2006，（22）：3173－3175.

[5]Todorovic－Rakovic N.Genome－based versus gene－based theory of cancer：possible implications for clinical practice[J].Biosc，2011，36（4）：719－724.

[6]Du J，Du Q，Zhang Y，etal.Expression of cell－cycle regulatory proteins BUBR1，MAD2，Aurora A，cyclin A and cyclin E in invasive ductal breast carcinomas[J].HistolHistopatho，2011，26（6）：761－768.

[7]Kabeche L，Compton D A.Checkpoint－independent stabilization of kinetochore－microtubule attachments by Mad2in human cells[J].CurrBio，2012，22（7）：638－644.

[8]Sotillo R，Hernando E，Díaz－Rodríguez E，etal.Mad2overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice[J].CancerCell，2007，11（1）：9－23.

[9]李愛香.Bubl、Mad2和突變型p53蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及意義[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2012.

[10]Ge S，Skaar J R，Pagano M.APC／C－and Mad2－mediated degradation of Cdc20during spindle checkpoint activation[J].CellCycle，2009，8（1）：167－171.

[11]Saitoh S，Kobayashi Y，Ogiyama Y，etal.Dual regulation of Mad2localization on kinetochores by Bub1and Dam1／DASH that ensure proper spindle interaction[J].MolBiolCel，2008，19（9）：3885－3897.