微刺激方案中成熟卵母細(xì)胞紡錘體參數(shù)與卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射結(jié)局間的關(guān)系

黃 亞，吳鋆龍，徐 利，葛鳳菊，陳亞寧，祁秀娟

（上海永遠(yuǎn)幸婦科醫(yī)院生殖中心，上海 200131）

在人類體外受精-胚胎移植 （in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET）技術(shù)中，胚胎質(zhì)量是影響臨床妊娠結(jié)局的重要因素，如何選擇最具發(fā)育潛能的胚胎用于移植，既能提高妊娠率，又能減少移植胚胎的數(shù)目，一直是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的方向。

成熟卵母細(xì)胞紡錘體出現(xiàn)在細(xì)胞減數(shù)分裂中期（metaphaseⅡ，MⅡ），為中間寬大逐漸向兩邊變窄的紡錘狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)。MⅡ紡錘體靠近卵母細(xì)胞的外圍，一端錨定于卵母細(xì)胞皮質(zhì)區(qū)，基本與卵母細(xì)胞膜垂直[1]。由大量微管縱向排列而成的紡錘體具有雙折射性，這是一種內(nèi)部排列高度規(guī)律的生物大分子所具有的光學(xué)特性，當(dāng)光進(jìn)入紡錘體時(shí)，會(huì)折射成2 束互相垂直、傳播速度不同的2 種偏振光，沿紡錘體短軸行進(jìn)的偏振光速度較快，而沿長(zhǎng)軸行進(jìn)的速度較慢，從而造成光程差的改變，這種對(duì)光的阻滯作用稱為紡錘體的阻滯性[2]。應(yīng)用偏振光顯微鏡和Oosight Imaging 軟件能夠?qū)忓N體的阻滯性進(jìn)行拍攝、測(cè)量，并通過(guò)特殊的算法對(duì)紡錘體照片進(jìn)行定量分析，計(jì)算出光程差的變化量，即阻滯值（單位為nm）。已有研究表明，卵母細(xì)胞紡錘體的存在及阻滯值與卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射 （intra cytoplasmic sperm injection，ICSI）的結(jié)局有關(guān)[3]，阻滯值越大，提示紡錘體中的微管排列越有序，胚胎具有更好的發(fā)育潛能[4]。但以往各研究中促排卵方案不盡相同，卵子成熟度也不甚同步，造成數(shù)據(jù)與結(jié)論不一致[5-6]。本文回顧性分析在本院生殖中心采用克羅米芬加人絕經(jīng)期促性腺激素（human menopausal gonadotropin,hMG）微刺激方案促排卵（該方案為我院的主流特色方案，其他中心只用于少數(shù)患者），并應(yīng)用紡錘體觀察儀觀察行ICSI 助孕患者卵母細(xì)胞的紡錘體，探討紡錘體是否可見(jiàn)以及阻滯值等參數(shù)與ICSI 結(jié)局間的關(guān)系，以期為臨床預(yù)測(cè)優(yōu)質(zhì)胚胎、囊胚形成的概率及挑選胚胎移植提供參考依據(jù)。

資料與方法

一、資料

2017 年12 月至2019 年6 月間，收集在上海永遠(yuǎn)幸婦科醫(yī)院生殖中心應(yīng)用紡錘體觀察儀觀察卵母細(xì)胞紡錘體后而行ICSI 患者的臨床資料。本研究獲得上海永遠(yuǎn)幸婦科醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

二、方法

1.患者的納入及分組： 根據(jù)ICSI 前能否觀察到紡錘體分為可見(jiàn)紡錘體組（SP+）和未見(jiàn)紡錘體組（SP-）；再根據(jù)患者年齡分為＜35歲組、35～40歲組、≥40歲組3個(gè)亞組。排除輸卵管積水、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢囊腫等可能影響卵子質(zhì)量和受精結(jié)局的患者；排除經(jīng)皮睪丸附睪穿刺取精行ICSI 的患者等；排除采用卵子激活后行ICSI 的患者以及取卵日確認(rèn)為未成熟卵母細(xì)胞而進(jìn)行體外培養(yǎng)成熟后行ICSI 的患者。

2.促排卵方案:采用克羅米芬加hMG 微刺激方案促排卵。患者于月經(jīng)周期第3 日開始口服枸櫞酸氯米酚 （高特制藥有限公司）50 mg/d 至扳機(jī)前1 d；在月經(jīng)周期第8 日開始給予肌肉注射尿促性素（hMG，麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司）150 IU，隔天1 次。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm 且每個(gè)卵泡平均血雌二醇水平≥200 pg/mL 時(shí)扳機(jī)，予皮下注射醋酸曲普瑞林（達(dá)必佳，輝凌制藥公司）0.1 mg，扳機(jī)35 h 后取卵。

3.卵子和精子準(zhǔn)備:經(jīng)陰道B 超引導(dǎo)下取卵，對(duì)獲取的成熟卵母細(xì)胞（MⅡ卵）培養(yǎng)2～3 h 后用透明質(zhì)酸酶消化去除卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞，待觀察紡錘體和行ICSI。精液采用Pureception（SAGE，美國(guó)）密度梯度離心法處理，處理后置于室溫，待行ICSI。

4.紡錘體的觀察與ICSI 操作： 使用由特殊材料制成的ICSI 操作皿（NIPRO，日本）進(jìn)行紡錘體觀察。每個(gè)操作皿用預(yù)先平衡好的含50%血清替代品（serum protein substitute,SPS） hepes 緩沖的人輸卵管液做3～5個(gè)小滴，將卵母細(xì)胞和精子加入不同的微滴中。使用Oosight 紡錘體成像系統(tǒng)（HAMILTON THORNE，美國(guó)）進(jìn)行觀察，首先在Live Video模式下選擇液滴的空白區(qū)域扣除背景，然后在Live Oosight 模式下拍攝有紡錘體的卵母細(xì)胞圖像，利用Oosight Meta 軟件測(cè)量紡錘體長(zhǎng)度、寬度及阻滯值、紡錘體與第一極體的角度。拍攝完成后，把紡錘體置于6 點(diǎn)鐘或12 點(diǎn)鐘位置進(jìn)行常規(guī)ICSI 操作，操作后的卵子按順序轉(zhuǎn)入20 μL 卵裂液（SAGE，美國(guó)）微滴中，每滴一個(gè)卵子，即放置入37 ℃下5%CO2、5%O2、90%N2的三氣培養(yǎng)箱 （KITAZATO，日本）中進(jìn)行單胚胎培養(yǎng)。

5.評(píng)價(jià)指標(biāo)

（1）受精判定：行ICSI 后16～20 h 觀察受精情況，見(jiàn)雙原核（2PN）為正常受精，單原核（1PN）或多原核（≥3PN）為異常受精。正常受精率=正常受精卵母細(xì)胞數(shù)/MⅡ卵數(shù)×100%；異常受精率=異常受精卵母細(xì)胞數(shù)/MⅡ卵數(shù)×100%。

（2）卵裂期胚胎評(píng)價(jià)：本中心結(jié)合2018 年《人類輔助生殖技術(shù)胚胎實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)質(zhì)控專家共識(shí)》與本中心情況，將卵裂期胚胎質(zhì)量分為5 級(jí)，見(jiàn)表1。本研究的優(yōu)質(zhì)胚胎（優(yōu)胚）是指受精第2 天細(xì)胞數(shù)為3～5個(gè)或者第3 天細(xì)胞數(shù)為6～10個(gè)，并且胚胎級(jí)別為Ⅰ～Ⅱ級(jí)的胚胎，優(yōu)先冷凍Ⅰ～Ⅱ級(jí)優(yōu)胚，Ⅲ～Ⅳ級(jí)胚胎全部行囊胚培養(yǎng)，形成囊胚再冷凍，Ⅴ級(jí)胚胎直接廢棄。卵裂率=卵裂胚胎數(shù)/正常受精卵母細(xì)胞數(shù)×100%；優(yōu)胚率=優(yōu)胚數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%；囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)數(shù)×100%。

6.凍融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer,FET）：全部采用激素替代周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，從月經(jīng)開始第10 天起采用B 超觀察子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)，當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8 mm 時(shí)，解凍胚胎行單胚胎移植。移植后常規(guī)采用黃體支持。移植后第14 天檢測(cè)血清β 人絨毛膜促性腺激素 （human chorionic gonadotropin β，β-HCG） 水平，β-HCG 陽(yáng)性者判定為生化妊娠，2 周后行B 超檢查，宮腔內(nèi)見(jiàn)到孕囊或原始心管搏動(dòng)者判定為臨床妊娠。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。不同年齡亞組間的比較采用one-way ANOVA 分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、患者及獲卵情況

本組共納入354例患者，平均年齡為 （37.4±5.3）歲，共獲卵1 542 枚，其中MⅡ卵1 095 枚，可見(jiàn)紡錘體組（SP+）915 枚（83.56%），未見(jiàn)紡錘體組（SP-）180 枚（16.44%）。各年齡亞組患者的卵泡刺激素 （follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH） 水平差異顯著，其中≥40歲組[（14.99±12.21） U/L]顯著高于＜35歲組[（12.28±8.35） U/L]以及35～40歲組[（12.22±1.66）U/L]（P 分別為0.032、0.019）。3個(gè)年齡亞組間的抗米勒激素（anti-Müllerian hormone，AMH）差異顯著，隨著年齡的增高而下降[（2.09±2.02） U/L 比（1.34±1.66） U/L 比（0.78±0.87） U/L]（P 均＜0.001）。隨年齡增高，各年齡組的人均獲MⅡ卵數(shù)有逐漸降低的趨勢(shì)，但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.189），而人均獲SP+卵數(shù)顯著降低，隨年齡組由小到大依次為（3.30±2.22）個(gè)、（2.91±2.10）個(gè)和（2.46±1.99）個(gè)（P=0.025）?；颊咂渌话闱闆r及激素水平見(jiàn)表2。

二、有無(wú)可見(jiàn)紡錘體與ICSI 結(jié)局間的關(guān)系（見(jiàn)表3）

SP+組的正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、囊胚形成率及臨床妊娠率均顯著高于SP-組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），SP+組異常受精率則低于SP-組（P＜0.000 1）（見(jiàn)表3）。

三、紡錘體的阻滯值等參數(shù)與ICSI 結(jié)局間的關(guān)系

在SP+組中，根據(jù)紡錘體阻滯值、體積、面積以及紡錘體與第一極體的角度共4個(gè)參數(shù)進(jìn)行比較，只有紡錘體阻滯值在正常受精組與異常受精組、卵裂組與未卵裂組、優(yōu)胚組與非優(yōu)胚組、囊胚形成組與囊胚未形成組、臨床妊娠組與臨床未妊娠組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他幾個(gè)參數(shù)在上述4 組中差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表4）。

表1 卵裂期胚胎質(zhì)量評(píng)價(jià)體系

表2 各年齡亞組患者激素水平與獲卵情況

表3 有無(wú)可見(jiàn)紡錘體的ICSI 結(jié)局比較（%）

表4 紡錘體阻滯值等參數(shù)與胚胎發(fā)育結(jié)局間的關(guān)系

四、患者年齡與紡錘體阻滯值的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)不同年齡組紡錘體阻滯值可以看出，隨著年齡的增長(zhǎng)，3 組的紡錘體阻滯值逐漸降低[分別為（2.1±0.6） nm、（2.0±0.6） nm 和（1.9±0.5） nm]，＜35歲組的紡錘體阻滯值顯著高于其他2 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02 和P＜0.001），35～40歲組與≥40歲組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.098）（見(jiàn)表5）。

表5 不同年齡組紡錘體的阻滯值

討論

一、影響紡錘體可見(jiàn)的因素

人卵母細(xì)胞的紡錘體是桶狀或紡錘狀的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，分別出現(xiàn)于卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂中期（MⅠ）和第二期減數(shù)分裂中期（MⅡ）。紡錘體通過(guò)微絲與染色體相互作用，在不同時(shí)期引導(dǎo)染色體的排列、運(yùn)動(dòng)和分離。以往研究提示可觀察到紡錘體的百分比差異較大，Wang 等[7]在研究中觀察到紡錘體的卵母細(xì)胞百分比為61.4%，而在García-Oro等[2]的研究中這一百分比為80.5%，造成這種差異的原因除了患者群體和促排卵方案的不同之外，還可能是由于人卵母細(xì)胞的紡錘體比較脆弱，容易受到外界環(huán)境的影響（如溫度和pH 的波動(dòng)），造成了微管的解聚[7]。Madaschi 等[8]僅在65.9%的卵母細(xì)胞中觀察到了紡錘體，也可能是由于觀察儀器的不同或者觀察時(shí)間點(diǎn)不同。本研究由于觀察的都是成熟卵母細(xì)胞，因此有83.56%的卵母細(xì)胞都觀察到了紡錘體。隨著年齡增長(zhǎng)，卵巢功能逐漸衰退，本研究中3個(gè)年齡亞組的人均獲卵數(shù)以及人均可見(jiàn)紡錘體MⅡ卵數(shù)也隨之降低。

二、紡錘體可見(jiàn)與否及阻滯值等參數(shù)與胚胎發(fā)育、妊娠結(jié)局間的關(guān)系

在第二次減數(shù)分裂過(guò)程中，紡錘體通過(guò)微管與染色體結(jié)合，引導(dǎo)姐妹染色單體發(fā)生有序分離。紡錘體異常往往導(dǎo)致受精失敗或異常、胚胎染色體異常、胚胎死亡、自然流產(chǎn)和遺傳性疾病的發(fā)生[7]。本研究中未見(jiàn)紡錘體的MⅡ卵異常受精率顯著高于可見(jiàn)紡錘體的MⅡ卵，說(shuō)明紡錘體的缺失可能會(huì)造成染色體的分離失敗，從而導(dǎo)致原核形成異常。朱亮等[9]的研究也證實(shí)了紡錘體對(duì)于胚胎早期卵裂（ICSI 后25～27 h）的發(fā)生起到顯著的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，可見(jiàn)紡錘體的MⅡ卵與未見(jiàn)紡錘體的MⅡ卵在幾個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)（受精率、正常受精率、異常受精率、卵裂率等）上都有明顯的差異[2,8,10]。本研究得出相同結(jié)論，而且本研究發(fā)現(xiàn)有紡錘體的MⅡ卵行ICSI 受精后囊胚形成率及臨床妊娠率更高，即有更好的臨床結(jié)局。

紡錘體的結(jié)構(gòu)異常會(huì)導(dǎo)致非整倍體卵子和胚胎，對(duì)ICSI 后胚胎發(fā)育的妊娠結(jié)局有不利影響[1]。已有研究對(duì)阻滯值與原核評(píng)分[11]、胚胎評(píng)級(jí)[12]和囊胚形成[13]之間進(jìn)行分析，結(jié)果表明較高的阻滯值提示組成紡錘體的微管具有更高的密度和更有序的排列，預(yù)示胚胎可能有更好的發(fā)育潛能，其結(jié)局會(huì)更好。在García-Oro 等[6]最近的薈萃分析中表明阻滯值可作為評(píng)判紡錘體結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)，其大小與妊娠率和活產(chǎn)率的高低都存在的顯著的關(guān)系。Tomari等[14]的研究指出，卵母細(xì)胞紡錘體阻滯值高者較該值低者有更好的正常受精率、優(yōu)胚率、囊胚形成率以及后續(xù)的臨床妊娠率，但卵裂率無(wú)差異。本研究中正常受精組、卵裂組、優(yōu)胚組、囊胚形成組以及臨床妊娠組的阻滯值均顯著高于異常受精組、未卵裂組、非優(yōu)胚組、囊胚未形成組及臨床未妊娠組，與前人的研究結(jié)論基本一致。同時(shí),本研究測(cè)量了紡錘體的長(zhǎng)和寬，計(jì)算紡錘體的體積、面積，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這2個(gè)指標(biāo)在各組間存在差異。另一方面，2013 年Korkmaz 等[5]發(fā)表的研究中對(duì)于紡錘體預(yù)測(cè)著床率有不確定的看法，這可能是由于各生殖中心胚胎評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，而且影響著床率的因素有多個(gè)，因此該結(jié)果仍需更大的樣本量加以分析，可進(jìn)一步結(jié)合囊胚培養(yǎng)及移植后的臨床結(jié)果，從而得出更為準(zhǔn)確的判定。

近年來(lái)，隨著社會(huì)的發(fā)展和醫(yī)療水平的提高，女性的生育觀念發(fā)生變化，生育年齡也在不斷提高,同時(shí)“全面二胎”政策的開放，高齡婦女的再生育問(wèn)題也給輔助生殖技術(shù)提出了更大的挑戰(zhàn)。高齡是導(dǎo)致人工助孕失敗的重要因素之一，關(guān)于紡錘體阻滯值研究的2 篇文獻(xiàn)都指出[11-12]，隨著年齡的增長(zhǎng)，紡錘體阻滯值出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。本研究也有相同的結(jié)果，尤其是40歲以上婦女卵母細(xì)胞的紡錘體阻滯值與35歲以下者相比，有顯著下降。因此，評(píng)估紡錘體阻滯值，選擇紡錘體可見(jiàn)而且阻滯值高的胚胎或者囊胚進(jìn)行移植，胚胎發(fā)育潛能更好，而患者越年輕對(duì)提高成功率越有幫助。

綜上所述，紡錘體的缺失常常會(huì)意味著受精異常的風(fēng)險(xiǎn),隨著年齡的增高，紡錘體的阻滯值逐漸降低。在行ICSI 前，胚胎學(xué)家應(yīng)觀測(cè)紡錘體是否存在，把紡錘體放在6 點(diǎn)或12 點(diǎn)的位置行ICSI 而不是傳統(tǒng)的以第一極體為基準(zhǔn)，從而可提高正常受精率和卵裂率，盡量降低異常受精的概率，增加有效胚胎的數(shù)量，優(yōu)選阻滯值高的卵子發(fā)育成的優(yōu)胚進(jìn)行移植，以提高臨床妊娠率。但本研究中樣本量不是足夠大，尤其是陰性結(jié)果的樣本偏少，還應(yīng)納入更多的樣本，隨訪更多樣本的移植結(jié)局（著床率和活產(chǎn)率）綜合分析，從而更準(zhǔn)確地評(píng)估阻滯值對(duì)優(yōu)胚和囊胚形成以及對(duì)移植結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值。