牙磨片的制作及蘇木精－伊紅染色法

高蘇鳳，姚麗艷，高美欽

牙體硬組織特別是牙釉質(zhì)無機(jī)物含量很高[1]，用常規(guī)脫鈣法制成牙切片，會(huì)使應(yīng)有的組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，故采用磨片觀察。而牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)無機(jī)物含量較牙釉質(zhì)低，有機(jī)物含量相對(duì)較高，要掌握其組織形態(tài)結(jié)構(gòu)以及它們之間的關(guān)系通常是磨片和切片結(jié)合起來觀察[2]，制作牙切片工序繁雜，耗時(shí)長(zhǎng)[3]。為簡(jiǎn)化程序，提高牙磨片的觀察效果，筆者嘗試采用蘇木精－伊紅（H－E）染色法將不脫鈣的牙片進(jìn)行染色以提高染色效果[4]，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 數(shù)碼顯微鏡（BA 310Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；慢速手機(jī)（EX－203，日本精工株式會(huì)社）；電子數(shù)顯卡尺（SIMCT，上海量具刃具廠）。甲醛溶液、蘇木素、伊紅Y、二甲苯、中性樹膠等（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)級(jí)顯微鏡載玻片、高品質(zhì)顯微鏡蓋玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本選擇和制作 收集新近拔除的下頜阻生第三磨牙，挑選牙體完整，牙合面無齲壞，根尖孔完全閉合的5顆，浸泡于10%甲醛溶液中1周，去凈牙周軟組織。取兩片金剛石磨片中間夾一片墊片（直徑7.5mm厚度0.6mm），固定在夾石針上，安裝到有噴水裝置的慢速手機(jī)直機(jī)頭上。取一塊白色泡沫在近邊緣處，挖除略小于牙齒體積的小洞，將牙齒嵌壓入，取牙冠的矢狀面由牙尖處入手，左手固定，右手以掌拇指法握持手機(jī)柄，拇指以牙齒為支點(diǎn)，腳踏開關(guān)，穩(wěn)固而緩慢地切割，將牙齒縱切成約0.6mm的薄片，挑選厚薄均勻，外形完好的牙片5片，放置粗油石上加鑄磨粉在保持濕潤(rùn)狀態(tài)下進(jìn)行研磨，用電子數(shù)顯卡尺測(cè)量厚度，磨至約0.3～0.4mm時(shí)，流動(dòng)水沖洗干凈，改用細(xì)油石研磨，邊磨邊滴水，使牙片表面的紋路消失，表面光滑、平整，磨薄至0.23～0.25mm厚度，流動(dòng)水反復(fù)沖洗，濾紙吸干水分。

1.2.2 試劑配制

1.2.2.1 Harris蘇木精染色液的配制 蘇木素1g，無水乙醇10mL，硫酸鋁鉀20g，蒸餾水200mL，氧化汞0.5g，冰醋酸8mL。先用無水乙醇溶解蘇木精，蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀，后將兩液合并煮沸30s，加入氧化汞，攪拌后以冰水冷卻，靜置過夜，過濾備用。使用前加入冰醋酸并混勻。

1.2.2.2 伊紅染色液的配制 伊紅Y 2g，蒸餾水20mL，冰醋酸1～2mL，將伊紅與蒸餾水混合溶解后滴加冰醋酸并攪拌呈黃紅色糊狀，過濾，棄去濾液。將沉淀物連同濾紙一起放入60℃溫箱中干燥，95%乙醇400mL溶解伊紅粉末。

1.2.3 H－E染色步驟

1.2.3.1 脫 蠟 二 甲 苯 Ⅰ 10min；二 甲 苯 Ⅱ10min；100%乙醇1～3min；95%乙醇1～3min；80%乙醇1～2min；70%乙醇1～2min；流水沖洗5～10min；蒸餾水1min。

1.2.3.2 染色程序 蘇木精染液染色5～10min，流水沖洗1～5min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒。流水沖洗藍(lán)化10～30min。伊紅染液染色10～30s，常規(guī)脫水，中性樹膠封固。

1.3 染色結(jié)果 牙釉質(zhì)不著色，牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)顯示鮮明、艷麗的紫紅色，與牙釉質(zhì)形成明顯對(duì)比（圖1）。牙釉質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)清晰，釉牙本質(zhì)界處呈許多褐色相連的小弧形線，凸面向著牙本質(zhì)，凹面向著釉質(zhì)，釉叢形似草叢、釉梭形似紡錘狀。在牙冠部牙本質(zhì)近釉質(zhì)牙本質(zhì)界處見淡紅色的不規(guī)則形狀的球間牙本質(zhì)，沿牙生長(zhǎng)線分布，邊緣呈凹形，像許多相接球體之間的空隙。牙本質(zhì)由無數(shù)呈紫紅色牙本質(zhì)小管貫穿，走向明顯，以牙髓腔為中心，向釉牙本質(zhì)界呈S型放射狀排列，近髓腔的第一個(gè)彎曲凸面朝向根尖部，第二個(gè)彎曲的凸面朝向牙冠，在牙尖和切緣處幾乎呈直線，牙本質(zhì)生長(zhǎng)線顏色略深呈彎曲狀與其垂直行走。牙本質(zhì)小管橫切面呈紫紅色網(wǎng)管狀。在牙根部的牙本質(zhì)近牙骨質(zhì)處見黑色小顆粒狀的托姆斯顆粒層（圖2）。牙骨質(zhì)顯示鮮明的紅色，顏色較牙本質(zhì)深，緊貼根部牙本質(zhì)表面，自牙頸部到近根尖1／3顯示紅色的層板狀結(jié)構(gòu)而無細(xì)胞。在無細(xì)胞牙骨質(zhì)表面和根尖及根分叉處，全部為細(xì)胞牙骨質(zhì)，見黑色的卵圓形陷窩，表面有許多細(xì)小的突起向牙周膜方向伸展，層板結(jié)構(gòu)較厚，平行排列的生長(zhǎng)線相距較遠(yuǎn)。釉質(zhì)牙骨質(zhì)界在牙頸部相接，不著色的釉質(zhì)與紅染的牙骨質(zhì)形成鮮明對(duì)比，牙釉質(zhì)與牙骨質(zhì)的連接情況清晰明了（圖3）。

圖1 H－E染色牙磨片圖片F(xiàn)ig 1 Photograph of H－E staining teeth grinding

圖2 牙縱斷磨片 （H－E染色 ×400）Fig 2 Longitudinal grinding of teeth（H－E staining ×400）

2 討 論

圖3 牙縱斷磨片 （H－E染色 ×100）Fig 3 Longitudinal grinding of teeth（H－E staining ×100）

掌握牙體組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是口腔組織病理學(xué)課程的重要內(nèi)容，對(duì)于臨床醫(yī)療和科研也具有較大的意義。如牙釉質(zhì)的點(diǎn)隙齲，一旦齲病深入至釉牙本質(zhì)界處，則很快向深部擴(kuò)展，窩洞制備時(shí)應(yīng)注意避免懸空釉柱的產(chǎn)生。牙本質(zhì)是構(gòu)成牙主體的硬組織，氟牙癥和維生素D缺乏時(shí)球間牙本質(zhì)明顯增多。牙本質(zhì)小管彎曲狀的排列，牙髓發(fā)生病變時(shí)有可能與牙體硬組織的病變不在同一水平上，治療時(shí)要估計(jì)到這種可能性。牙骨質(zhì)內(nèi)沒有血管，其吸收力弱于骨組織的生物學(xué)特性，有助于達(dá)到正畸治療的目的。常規(guī)的牙齒石蠟切片法，需脫鈣變軟后才能切片，牙體組織結(jié)構(gòu)特別是牙釉質(zhì)無機(jī)物含量高，經(jīng)脫鈣后，鏡下只能觀察為無色透明的一薄層，甚至見不到其痕跡，無法進(jìn)行觀察研究[5]。吳哲等采用MMA包埋技術(shù)，不脫鈣的牙齒包埋后片切[5]，但存在操作麻煩、切片易與載玻片分離、皺褶碎裂等缺陷。筆者對(duì)傳統(tǒng)牙磨片的技術(shù)方法進(jìn)行改進(jìn)，將牙體片切，磨薄后染色，操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，可以同時(shí)顯示牙體硬組織的組織結(jié)構(gòu)特征。但牙髓等軟組織的結(jié)構(gòu)在制片過程中遭到破壞，因此尚需對(duì)技術(shù)進(jìn)一步探討。

由于牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)鈣化程度不同，有機(jī)物含量不一，選擇新鮮的牙齒可以盡可能少地影響牙體的理化特性，保證制片的質(zhì)量，在片切時(shí)不易使牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)脫離，可以提高成功率。牙片磨薄的厚度，以0.23～0.25mm為最佳，且厚薄要一致、表面光滑無劃痕，有利于著色均勻。牙片磨薄時(shí)，應(yīng)根據(jù)手感辨別磨處的厚薄而施力，否則會(huì)出現(xiàn)釉質(zhì)很厚，鏡下觀察不到清晰的結(jié)構(gòu)，而牙本質(zhì)已磨薄，甚至磨穿，過薄使應(yīng)有的組織結(jié)構(gòu)被磨去。操作時(shí)要整個(gè)手指指腹緊貼牙片，與油石成30°角。粗磨時(shí)加上鑄磨粉在保持濕潤(rùn)狀態(tài)下進(jìn)行研磨可以提高效率，細(xì)磨時(shí)以水為介質(zhì)，縱橫交替研磨。

進(jìn)行H－E染色時(shí)技術(shù)關(guān)鍵：（1）蘇木素染色的時(shí)間。依據(jù)蘇木精染液的成熟程度、磨片的厚薄、室溫等而定，一般染5min。對(duì)于較厚的磨片相對(duì)要縮短染色時(shí)間。如染液使用時(shí)間較長(zhǎng)或氣溫較低則需延長(zhǎng)染色時(shí)間。（2）鹽酸分化（將過度染色的或不需著色的組織成分上的顏色除去）程度的把握。分化不充分結(jié)構(gòu)模糊不清，分化過度則對(duì)比度差。分化過程中應(yīng)將磨片置于顯微鏡下觀察控制，以達(dá)到背景清晰，牙本質(zhì)小管呈紫紅色。（3）藍(lán)化是指用蘇木素液染色后，通過鹽酸分化，磨片從酸性環(huán)境中轉(zhuǎn)移到流水中使之變藍(lán)的過程。藍(lán)化時(shí)間15～30min，并在顯微鏡下控制。如沖水不充分，因組織磨片有酸的成分存在，容易褪色，不利于磨片的保存。

[1]于世鳳，孫宏晨，李 江，等.口腔組織病理學(xué)[M].7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：53.

[2]李 萍，宋 萍，魏 丹，等.學(xué)生自制牙體組織磨片在口腔組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，30（3）：419－420.

[3]梁英杰，凌啟波，張 威，等.臨床病理學(xué)技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：12.

[4]姚麗艷，趙 偉，呂紅兵，等.3種脫鈣液對(duì)牙體牙周聯(lián)合切片H－E染色效果的對(duì)比[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，40（3）：298－301.

[5]程 敏，洪麗華，張澤兵，等.鐘狀晚期牙胚和牙及牙周組織的特殊染色應(yīng)用探討[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（2）：213－215.

[6]吳 哲，馬冬麗，洪麗華，等.不脫鈣的牙齒骨骼塑料包埋制片技術(shù) 及 方 法 探 討 [J].華 西 口 腔 醫(yī) 學(xué) 雜 志，2006，24（6）：564－565.