細(xì)胞牙骨質(zhì)發(fā)育的組織形態(tài)學(xué)觀察

于西佼，杜言梅，姜 歡，杜 毅

(濟(jì)南市口腔醫(yī)院牙體牙髓科，山東濟(jì)南 250001)

赫特威爾氏上皮根鞘(Hertwig＇s epithelial root sheath，HERS)是牙根發(fā)育過(guò)程中上皮－間充質(zhì)所發(fā)生的一系列交互信號(hào)誘導(dǎo)而得以實(shí)現(xiàn)的重要且唯一的上皮性結(jié)構(gòu)［1］。本實(shí)驗(yàn)選擇出生后不同時(shí)期BALB/c小鼠的下頜第一磨牙根尖1/3區(qū)細(xì)胞牙骨質(zhì)，追蹤觀察其細(xì)胞牙骨質(zhì)在發(fā)育過(guò)程中的組織形態(tài)和細(xì)胞活性改變，以探討來(lái)源于上皮根鞘斷裂的上皮性細(xì)胞是否參與細(xì)胞牙骨質(zhì)的發(fā)育。為進(jìn)一步研究牙骨質(zhì)發(fā)育時(shí)的交互誘導(dǎo)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)牙骨質(zhì)的再生提供前期研究基礎(chǔ)［2－3］。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

In situ Cell Death Detection Kit(Roche，德國(guó));Mouse monoclona to cytokeratin 14(Abcam，UK);PV免疫組化兩部法試劑盒、AEC顯色劑、ClearmountTM封片劑(北京中杉);蛋白酶 K(MERK，德國(guó));Tris/HCI、多聚賴氨酸(Sigma，美國(guó));RM2135切片機(jī)(LEICA，德國(guó));OLYMPUS CX71顯微鏡及照相系統(tǒng)、JEM－1200EX透射電鏡(Olympus，日本)。

1.2 標(biāo)本制備

分別取出生后15、19、25 d的BALB/c小鼠各8只(山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，引頸處死后解剖分離其雙側(cè)含下頜第一磨牙的下頜骨段。其中一側(cè)分別經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定、100 g/L EDTA脫鈣1個(gè)月后，梯度乙醇脫水、石蠟包埋，制作近遠(yuǎn)中向5 μm連續(xù)切片;分別用于根尖1/3區(qū)牙骨質(zhì)發(fā)育的常規(guī)組織學(xué)觀察、免疫組化和細(xì)胞凋亡檢測(cè)。另一側(cè)置于25 mL/L戊二醛液中4℃下固定，用于透射電鏡觀察。

1.3 PV免疫組化染色法檢測(cè)CK14的表達(dá)

上述石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化至水，并用30 mL/L過(guò)氧化氫液室溫孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性;然后分別滴加CK14單克隆抗體(1∶100稀釋)，37℃溫箱孵育1 h;PBS洗2 min×3次，滴加羊抗鼠IgG抗體－HRP多聚體，37℃孵育20 min;PBS漂洗，AEC溶液顯色;蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染30 s;常規(guī)脫水、透明、水溶性ClearmountTM封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，顯微鏡下觀察CK14的表達(dá)情況(細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕紅色顆粒者為陽(yáng)性表達(dá)，藍(lán)色者為陰性)。

1.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

上述石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化至水，并用30 mL/L過(guò)氧化氫液室溫處理7 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。分別經(jīng)DDW(double distilled water)沖洗、0.1 mol/L PBS液(pH 7.4)洗2 min×3次后，滴加 16.2 μg/mL 蛋白酶 K(10 mmol/L Tris/HCI pH 7.4)，37℃溫箱孵育消化 10 min;DDW沖洗，PBS洗2 min×3次，每張切片滴加20 μL的TUNEL反應(yīng)液(1號(hào)液與2號(hào)液按1∶9混合配制，1號(hào)液為末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶TdT，2號(hào)液為核苷酸混合液)，置于濕盒中37℃ 溫箱孵育90 min;DDW沖洗，PBS洗2 min ×3次，滴加正常山羊血清室溫處理10 min，以減少非特異性結(jié)合;PBS洗2 min×3次，滴加酶標(biāo)記的抗熒光素抗體轉(zhuǎn)化劑－POD(3號(hào)液)，濕盒內(nèi)37℃溫箱孵育30 min;DDW沖洗，PBS洗2 min ×3次，滴加DAB顯色劑鏡下顯色;DDW終止顯色反應(yīng)后沖洗，蘇木精復(fù)染30 s;自來(lái)水沖洗5 min，常規(guī)脫水、封片。以PBS液代替TUNEL反應(yīng)液作陰性對(duì)照，顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的表達(dá)情況(細(xì)胞核呈棕黃色或褐色著色者為陽(yáng)性表達(dá))。

1.5 透射電鏡觀察

分別取25 mL/L戊二醛液4℃下初固定48 h后的各小鼠一側(cè)下頜骨，初步修剪后置于100 g/L EDTA液中脫鈣2周;0.1 mol/L PBS液(pH 7.4)沖洗后再置于10 g/L鋨酸液中后固定2 h;梯度乙醇(300、500、700、850、950 mL/L 和無(wú)水乙醇 3 次)脫水后，換置環(huán)氧乙烷并逐步過(guò)渡到Spurr包埋劑中進(jìn)行包埋;升溫聚合后，修塊切片，堿性品紅－亞甲藍(lán)染色1～2 min;水沖后顯微鏡下觀察定位，并進(jìn)一步修塊、制作80 nm超薄切片;然后用醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，JEM－1200EX透射電鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化和細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

BALB/c小鼠出生后第15天，其下頜第一磨牙即有細(xì)胞牙骨質(zhì)開(kāi)始形成;出生后第19天，可見(jiàn)根尖1/3區(qū)被細(xì)胞牙骨質(zhì)覆蓋，細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)部分被埋入或正被埋入的胞核呈棕黃色，部分呈藍(lán)色，提示細(xì)胞凋亡表達(dá)陽(yáng)性 (圖1)。免疫組化染色結(jié)果顯示，CK14陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)呈棕紅色，出生后第15～19天，處于細(xì)胞牙骨質(zhì)形成階段，成牙骨質(zhì)細(xì)胞被新形成的牙骨質(zhì)基質(zhì)埋入從而成為牙骨質(zhì)細(xì)胞;而在被埋入或即將埋入的細(xì)胞中可見(jiàn)部分細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CK14，提示其上皮性來(lái)源(圖2)。

2.2 超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

上皮根鞘斷裂后，在HERS細(xì)胞的外側(cè)可見(jiàn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的存在，BALB/C小鼠出生后第15天時(shí)，可見(jiàn)部分上皮性細(xì)胞在根面被成牙骨質(zhì)細(xì)胞分泌的基質(zhì)所包圍(圖3);出生后第19天，部分HERS斷裂后的上皮性細(xì)胞轉(zhuǎn)移到了牙周膜內(nèi)形成上皮剩余，并出現(xiàn)異染色質(zhì)比率增加、月型改變等細(xì)胞凋亡征象(圖4)。伴隨牙齒萌出，牙骨質(zhì)形成較快，可見(jiàn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞正被牙骨質(zhì)基質(zhì)埋入(圖5)或已經(jīng)被埋入而成為牙骨質(zhì)細(xì)胞(圖6)。出生后第25天時(shí)，伴隨成熟牙骨質(zhì)的厚度增加，在細(xì)胞牙骨質(zhì)陷窩內(nèi)可見(jiàn)牙骨質(zhì)細(xì)胞(圖7～8)。

圖1 小鼠根尖1/3區(qū)細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)(箭頭示)(TuNEL，a.×20;b.×40)

圖2 CK14陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞埋入牙骨質(zhì)基質(zhì)中(箭頭示)(PV，×40)

圖3 成牙骨質(zhì)細(xì)胞分泌的基質(zhì)包圍牙根表面的上皮性細(xì)胞團(tuán)(箭頭示橋粒連接)

圖4 成牙骨質(zhì)細(xì)胞內(nèi)大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，提示其分泌功能活躍;可見(jiàn)異染色質(zhì)比率增加、出現(xiàn)月型改變的上皮剩余細(xì)胞團(tuán)

圖5 成牙骨質(zhì)細(xì)胞正被牙骨質(zhì)基質(zhì)埋入

圖6 成牙骨質(zhì)細(xì)胞已被牙骨質(zhì)基質(zhì)埋入成為牙骨質(zhì)細(xì)胞

圖7 細(xì)胞牙骨質(zhì)

圖8 牙骨質(zhì)細(xì)胞位于陷窩內(nèi)，并可見(jiàn)細(xì)胞突起

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察出生后不同時(shí)期BALB/C小鼠根尖1/3區(qū)細(xì)胞牙骨質(zhì)的發(fā)育情況，以探討上皮根鞘斷裂后的上皮性細(xì)胞是否參與細(xì)胞牙骨質(zhì)的發(fā)育。結(jié)果顯示，細(xì)胞角蛋白14能較特異的標(biāo)記上皮根鞘細(xì)胞，從而可以追蹤上皮根鞘斷裂后的結(jié)局和轉(zhuǎn)歸［3－4］;部分被埋入或即將埋入牙骨質(zhì)基質(zhì)的細(xì)胞呈CK14陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明了這些細(xì)胞為上皮性來(lái)源;超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，根面的上皮性細(xì)胞被其外側(cè)成牙骨質(zhì)細(xì)胞分泌的基質(zhì)包圍，提示上皮根鞘細(xì)胞斷裂后產(chǎn)生的上皮細(xì)胞可能通過(guò)成為牙骨質(zhì)細(xì)胞而參與細(xì)胞牙骨質(zhì)的形成。

根據(jù)牙骨質(zhì)的細(xì)胞分布和纖維來(lái)源，可將牙骨質(zhì)分為5種類型:無(wú)細(xì)胞無(wú)纖維牙骨質(zhì)(AAC)、無(wú)細(xì)胞外源性纖維牙骨質(zhì)(AEFC)、有細(xì)胞固有纖維牙骨質(zhì)(CIFC)、無(wú)細(xì)胞固有纖維牙骨質(zhì)(AIFC)、有細(xì)胞混合性分層牙骨質(zhì)(CMSC)。無(wú)細(xì)胞外源性纖維牙骨質(zhì)一般位于牙根近冠方的1/3，含有密集排列的膠原纖維，方向與牙根面垂直。CMSC為AEFC和CIFC不規(guī)則交替沉積而成，通常分布在根分歧區(qū)及根尖區(qū);該類牙骨質(zhì)既含有成牙骨質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的平行于根面排列的膠原纖維，也含有外源性穿通纖維，牙骨質(zhì)細(xì)胞分布其中。最靠近牙本質(zhì)區(qū)域?yàn)镃IFC，其纖維與牙本質(zhì)纖維呈交錯(cuò)混合排列，起附著作用;AEFC位于近牙周膜側(cè)，含大量穿通纖維，這些纖維插入其深面的CIFC中［5］。牙骨質(zhì)再生的最終目的是誘導(dǎo)AIFC和CMSC的形成，其中CIFC除參與構(gòu)成CMSC外，還是修復(fù)性牙骨質(zhì)的一種類型，由成牙骨質(zhì)細(xì)胞形成，能對(duì)牙骨質(zhì)吸收或缺陷區(qū)、根折區(qū)進(jìn)行修復(fù)。

HERS是牙根發(fā)育中的決定性結(jié)構(gòu)，是牙根發(fā)育過(guò)程中上皮－間充質(zhì)所發(fā)生的一系列交互信號(hào)誘導(dǎo)而得以實(shí)現(xiàn)的重要且唯一的上皮性結(jié)構(gòu)［6］。斷裂后的HERS細(xì)胞部分轉(zhuǎn)移到了牙周膜內(nèi)形成上皮剩余(epithelial cell rests of Malassez，ERM)，并終生存在于牙齒發(fā)育完成后的牙周組織中。有研究已證實(shí)，上皮剩余在牙周組織內(nèi)環(huán)境的維系［7］、牙骨質(zhì)修復(fù)［8］等方面均發(fā)揮重要作用［9］。但是，這些來(lái)源于斷裂HERS的上皮細(xì)胞是否在細(xì)胞牙骨質(zhì)形成中也存在上皮－間充質(zhì)交互信號(hào)誘導(dǎo)，將會(huì)成為我們進(jìn)一步研究的方向;并在此基礎(chǔ)上深入研究不同類型牙骨質(zhì)發(fā)育的機(jī)理，從而最終實(shí)現(xiàn)真正的牙骨質(zhì)再生。

［1］Luan X，Ito Y，Diekwisch TG.Evolution and development of Hertwig＇s epithelial root sheath［J］.Dev Dyn，2006，235(5):1167－1180.

［2］Yang Y，Ge Y，Chen G，et al.Hertwig＇s epithelial root sheath cells regulate osteogenic differentiation of dental follicle cells through the Wnt pathway［J］.Bone，2014，63:158 －165.

［3］Wang Y，Lv L，Yu X，et al.The characteristics of epithelial cell rests of Malassez during tooth eruption of development mice［J］.J Mol Histol，2014，45(1):1 －10.

［4］Xiong J，Gronthos S，Bartold PM.Role of the epithelial cell rests of Malassez in the development，maintenance and regeneration of periodontal ligament tissues［J］.Periodontol，2000，2013，63(1):217－233.

［5］Bosshardt D，Nanci A.Structure of periodontal tissues in health and disease［J］.Periodontol，2000，2006(40):11 －28.

［6］Lee JH，Lee DS，Nam H，et al.Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast－lineage and Hertwig＇sepithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas－Fas ligand pathway［J］.Eur J Oral Sci，2012，120(1):29－37.

［7］Fujiyama K，Yamashiro T，F(xiàn)ukunaga T，et al.Denervation resulting in dento－alveolar ankylosis associated with decreased Malassez epithelium［J］.J Dent Res，2004，83(8):625 －629.

［8］Rincon JC，Xiao Y，Young WG，et al.Production of osteopontin by cultured porcine epithelial cell rests of Malassez［J］.J Periodontal Res，2005，40(5):417 －426.

［9］Nam H，Kim J，Park J，et al.Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig＇s epithelial root sheath/Epithelialrests of Malassez cells［J］.Mol Cells，2011，31(4):355－360.