依普利酮下調(diào)TNF-α、NF-κB抑制細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的研究

梁麗娟，王 箏，王 蕊，沈正東，李 莉，姜國旺，張曉曼，安亞娟，許慶友

腎小管間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各種腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎衰竭的最終共同通路。肌成纖維細(xì)胞(MyoF)與RIF的發(fā)生有著密切的關(guān)系，是RIF發(fā)生的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，而α-SMA作為腎小管上皮細(xì)胞－肌纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的特異性標(biāo)志物在RIF進(jìn)展中的重要性日益受到人們的關(guān)注。

本研究采用單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型，觀察依普利酮(eplerenone，Epl)對(duì)炎性介質(zhì)TNF-α、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)控作用以及上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志物α-SMA異常表達(dá)的抑制效應(yīng)，探討Epl拮抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用清潔級(jí)♀ Wistar大鼠36只，體質(zhì)量180～200 g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，分為假手術(shù)組、UUO組、依普利酮組，每組12只。

1.2 藥物及試劑 依普利酮由諾華公司提供;TNF-α 抗體選用 Santa Cruz產(chǎn)品;NF-κB(p65)、α-SMA、GAPDH抗體均選用Epitomics抗體。

1.3 造模方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水，溫度(22±2)℃。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，大鼠給予10%水合氯醛注射后，于左側(cè)中腹部切開皮膚，游離左側(cè)輸尿管，分別在輸尿管上1/3處和中1/3處用絲線結(jié)扎，切斷輸尿管，逐層縫合皮膚。假手術(shù)組僅將輸尿管游離但不結(jié)扎離斷。依普利酮組大鼠給予依普利酮100 mg·kg－1·d－1。d 10 后摘取左側(cè)腎臟，部分組織置于4%多聚甲醛中固定，脫水、石蠟包埋，切片行HE、Masson及免疫組化染色;其余組織 －70℃低溫保存以備檢測(cè)蛋白及mRNA。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 HE、Masson 染色觀察腎臟病理改變

1.4.2 免疫組化檢測(cè) TNF-α、NF-κB、α-SMA 表達(dá)

采用SABC法檢測(cè)，一抗?jié)舛染鶠?∶100，4℃過夜;滴加二抗，滴加SABC復(fù)合物，DAB顯色，以光鏡下出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.4.3 Western blot檢測(cè) TNF-α 、NF-κB、α-SMA 蛋白表達(dá) 冰凍腎組織給予裂解液(含蛋白酶抑制劑)提取并測(cè)定蛋白含量;取樣品按比例加入loading buffer，95℃ 煮沸 5 min后待電泳;配制 SDSPAGE 膠，上樣蛋白 20 μg，電泳 90V 到底;0.22 μm PVDF膜(甲醛處理)，20V，40 min半干轉(zhuǎn);5%脫脂牛奶封閉2～4 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃過夜，TBST清洗 3次，每次 10min;加入二抗(1∶20 000)，室溫60 min，TBST清洗3次，每次10 min，TBS清洗10 min后顯影，所得結(jié)果使用內(nèi)參較正。

1.4.4 Real time-PCR 檢測(cè) TNF-α 表達(dá) 提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA后擴(kuò)增。Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG(2 × )10 μl，F(xiàn)orward primer(10 μmol·L－1)0.4 μl，Reverse primer(10 μmol·L－1)0.4 μl，ROX Reference Dye 0.4 μl，Template 2 μl，ddH2O 6.8 μl，Total volume 為 20 μl 。引物由Invitrogen公司合成。TNF-α引物序列為:上游引物:5'-GAAAGTCAGCCTCCTCTCCG-3'，下游引物:5'-CTTGGGCAGGTTGACCTCAG-3'。β-actin 引物序列為:上游引物:5'-ATGTACGTAGCCATCCAGGC-3'，下 游 引 物:5'-GGCGTGAGGGAGAGCATAG-3'。PCR擴(kuò)增條件:95℃變性2 min(95℃15 s，各自的退火溫度，60℃ 34 s)40個(gè)循環(huán);50℃變性2 min。采用2－△△CT方法分析基因表達(dá)相對(duì)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)資料結(jié)果使用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。各組數(shù)據(jù)比較前先進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)性及方差齊性者，采用單因素方差分析，多組比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用LSD檢驗(yàn);不滿足者采用秩和檢驗(yàn)。數(shù)值變量以ˉ±s表示。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般情況 假手術(shù)組大鼠精神狀況、活動(dòng)、毛發(fā)、飲食、飲水等無明顯改變。UUO組大鼠表現(xiàn)為煩躁、易激惹，飲食、飲水量下降、體重減輕。依普利酮組一般狀況略好于UUO組(Tab 1)。

Tab 1General situation of animals(ˉ±s)

Tab 1General situation of animals(ˉ±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group

Group Body weight/g Water intake/ml Left kidney weight/body weight(%)?Sham 203.3 ±14.39 18.8 ±3.59 0.0028 ±0.0001 UUO 189.0 ±10.87* 14.6 ±3.34* 0.0125 ±0.0047＊＊Epl 191.0 ±11.96 16.1 ±4.35 0.0097 ±0.0047＊＊

2.2 腎臟組織病理學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示:假手術(shù)組小鼠腎臟組織表現(xiàn)未見異常，上皮細(xì)胞排列正常，無細(xì)胞水腫。UUO組腎組織大量上皮細(xì)胞壞死、脫落，細(xì)胞濁腫，組織水腫;腎小管明顯擴(kuò)張，大量炎性細(xì)胞浸潤。依普利酮組腎臟損傷與UUO組基本相同。Masson結(jié)果顯示:假手術(shù)組腎間質(zhì)僅有少量纖維成分，結(jié)構(gòu)清晰。UUO組膠原成分明顯增多，呈條索狀或片狀沉積于腎小管間質(zhì)，腎小管萎縮。依普利酮治療組腎間質(zhì)膠原成分較假手術(shù)組增多，但較UUO組明顯減輕(Fig 1、2)。

Fig 1 HE staining of kidney in rats with UUO

Fig 2 Masson staining of kidney in rats with UUO

2.3 腎組織 TNF-αmRNA 的表達(dá) 采用 Real time-PCR測(cè)定TNF-α mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示模型組較假手術(shù)組表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異有顯著性;依普利酮組較UUO組明顯下調(diào)，差異有顯著性(Fig 3)。

Fig 3 Expression of TNF-α mRNA in UUO ratswith Real time-PCR(n=3)

2.4 腎組織TNF-α及 NF-κB的表達(dá) 假手術(shù)組TNF-α及NF-κB呈弱表達(dá)，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞;UUO組TNF-α及NF-κB表達(dá)明顯增強(qiáng)，近曲小管尤為明顯;依普利酮組TNF-α及NF-κB表達(dá)范圍及強(qiáng)度較UUO組均明顯減弱(Fig 4、5)。

Fig 4 Expression of TNF-α in UUO rats with immunohistochemistry(10×20)

Fig 5 Expression of NF-κB in UUO rats with immunohistochemistry(10×20)

2.5 腎組織α-SMA的免疫組化檢測(cè) 假手術(shù)組α-SMA僅表達(dá)于血管，腎間質(zhì)及上皮細(xì)胞未見表達(dá);UUO組表達(dá)明顯增強(qiáng)，以擴(kuò)張的腎小管表達(dá)為甚，間質(zhì)亦可見到陽性表達(dá);依普利酮組α-SMA局部呈中度表達(dá)，間質(zhì)可見少量表達(dá)，較UUO組明顯減弱(Fig 6)。

2.6 腎組織 TNF-α、NF-κB、α-SMA 的蛋白表達(dá)采用 Western blot檢測(cè)腎組織 TNF-α、NF-κB、α-SMA蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示 UUO 組 TNF-α、NF-κB、α-SMA表達(dá)均較假手術(shù)組明顯增強(qiáng);依普利酮組的表達(dá)較UUO組明顯減弱(Tab 2、Fig 7)。

3 討論

炎癥損傷在慢性疾病進(jìn)展中的作用越來越受到重視，盡管起始因素不同，其持續(xù)進(jìn)展過程中，炎癥損傷發(fā)揮著關(guān)鍵作用，故抗炎治療對(duì)于慢性疾病的治療有著重要作用［1］。慢性腎臟的損傷過程中，有多種因素共同發(fā)揮作用，如血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子、氧化損傷、RAS激活等。目前，對(duì)于血管緊張素Ⅱ的作用較為關(guān)注，ACEI及ARB的臨床應(yīng)用減緩了腎臟疾病的進(jìn)展，有效地保護(hù)了腎功能。但不少患者，即便足量的ACEI及ARB治療亦未能有效，說明有其他因素如氧化損傷、炎癥損傷等因素的參與。近年來，隨著對(duì)腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)的深入研究，醛固酮對(duì)腎臟的損傷作用得以重視。當(dāng)腎臟損傷時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)醛固酮的活化，而醛固酮的活化又加重了腎臟的損傷，醛固酮活化后會(huì)誘導(dǎo)氧化損傷、炎癥損傷，并與血管緊張素 II相互作用［2－4］。阻斷醛固酮的炎癥損傷作用，對(duì)于減緩腎臟病的進(jìn)展有重要意義。

Fig 6 Expression of α-SMA in UUO rats with immunohistochemistry(10×20)

Tab 2 Expression of TNF-α，NF-κB and α-SMAin kidney of UUO rats with Western blot(n=4)

Fig 7 Expression of TNF-α、NF-κB、α-SMA in UUO rats with Western blot

腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟疾病進(jìn)展至后期的組織學(xué)改變［5］，小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化參與了纖維化的進(jìn)程。當(dāng)小管上皮細(xì)胞受到刺激后，轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，其標(biāo)志物為α-SMA，不僅可以游走，且較固有成纖維細(xì)胞更多地分泌細(xì)胞外基質(zhì)。α-SMA在正常腎臟僅表達(dá)于血管，若小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)有α-SMA的表達(dá)，說明腎臟的小管上皮細(xì)胞以及處于靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。因此，有效地控制其細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化將對(duì)腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展起到抑制作用。

細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化與血管緊張素Ⅱ、轉(zhuǎn)化生長因子-β以及一些炎性介質(zhì)有關(guān)，其中TNF-α以及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在其中起著關(guān)鍵作用。TNF-α是公認(rèn)的直接炎性因子，在體內(nèi)介導(dǎo)了廣泛的細(xì)胞反應(yīng)，是參與多種生理和免疫過程的重要遞質(zhì)。TNF-α可刺激系膜細(xì)胞表達(dá)黏附分子、血管活性肽等細(xì)胞因子，并刺激成纖維細(xì)胞增生，促進(jìn)膠原纖維的沉積［6］。TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制是通過NF-κB通路，刺激其活化，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。TNF-α與其受體 TNF-αR1結(jié)合后激活TRADD，釋放TRAF2，與 IKK結(jié)合，此復(fù)合物被 RIP激活，可使 IκBα 磷酸化，從 NF-κB分離，從而激活炎性反應(yīng)基因 NF-κB［7－8］。本實(shí)驗(yàn)觀察磷酸化的NF-κB(p65)改變，檢測(cè)其活性，證實(shí)其高表達(dá)可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，影響腎小管上皮細(xì)胞表型的改變并表達(dá)α-SMA。

NF-κB的激活被認(rèn)為是細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的啟動(dòng)因素［9］，而活化的 NF-κB 反過來又增加 TNF-α 的形成，兩者相互促進(jìn)，使 NF-κB與 TNF-α 形成反饋環(huán)［10］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNF-α在梗阻性腎病小管上皮細(xì)胞呈高表達(dá)，與NF-κB、α-SMA表達(dá)呈正相關(guān)。

TNF-α的產(chǎn)生與多種因素有關(guān)，在梗阻性腎病中，其高表達(dá)考慮為醛固酮所介導(dǎo)。腎臟疾病進(jìn)展中，腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)除了對(duì)血液動(dòng)力學(xué)有調(diào)控作用外，亦可引起氧化損傷、炎癥損傷，血管緊張素Ⅱ在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。此外，醛固酮的激活在炎癥損傷中的作用也得以證實(shí)［4］，故阻斷醛固酮的效應(yīng)可能具有腎臟保護(hù)作用。

依普利酮是新型的具有高度選擇性的醛固酮受體阻斷劑，目前在國外作為高血壓、心臟病、腎臟病的主要治療藥物，大量的研究證實(shí)鹽皮質(zhì)激素受體阻斷劑可以抑制 NF-κB活化、氧化損傷、動(dòng)脈重構(gòu)、炎性損傷、心臟纖維化和腎臟損傷等［11］。之前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)依普利酮具有抑制細(xì)胞增殖，減輕腎損傷的作用［3、12］。依普利酮的劑量根據(jù)國外文獻(xiàn)及我們前期的實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以 100 mg·kg－1·d－1為宜，體外實(shí)驗(yàn)可設(shè)計(jì)不同的劑量。本次實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果證實(shí)依普利酮可以通過TNF-α/NF-κB通路，下調(diào)炎性介質(zhì)表達(dá)，抑制其信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，從而減輕腎臟損傷。

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